分枝オリゴ糖生成酵素のX線結晶構造解析とタンパク質工学

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460147
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 坂野 好幸 東京農工大学, 農学部, 教授 (70014959)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 酒井 坦 静岡県立大学, 大学院・生活健康科学研究科, 教授 (10092214) ; 神鳥 成弘 東京農工大学, 工学部, 助教授 (00262246) ; 西河 淳 東京農工大学, 農学部, 助教授 (30218127)
• Keywords: プルラン / サイクロデキストリン / α-アミラーゼ / TVA / イソプルラナーゼ / 結晶構造解析

Research Abstract

本研究では、TVAIやイソプルラナーゼなど特徴的な基質特異性を持つ分枝オリゴ糖生成酵素を材料に、酵素の構造機能相関を分子レベルで明らかにすることを目的としている。本年度は、以下のようにTVAIのα(1→4)-およびα(1→6)-グルコシド結合の認識機構を分子レベルで明らかにし、またイソプルラナーゼの触媒残基を明らかにするなどの成果を得た。
【TVAIのα(1→4)-およびα(1→6)-グルコシド結合の認識機構の解析】α-アミラーゼファミリーには、一次構造上4つの保存領域が存在し、このうち2番自の保存領域に変異を導入したTVAIではα(1→6)-グルコシド結合に対する活性に変化はみられないが、α(1→4)-グルコシド結合に対する分解活性は大幅に低下していることが分かっている。本研究では、TVAI変異酵素のX線結晶構造解析を行い1.4〜2.1Å分解能で構造を決定した。さらに本結果をもとに変異酵素を構築しHPAECで反応の解析を行い、特にアラニン357のバリンへの置換が、基質の取り込みに続くその後の反応過程においてα(1→4)-結合に対してのみ影響を及ぼし、その結果α(1→4)-結合に対する特異的なkcat値の減少を起こすと考えられた。
【イソプルラナーゼの触媒残基の解析】イソプルラナーゼおよび一次構造の類似した酵素ファミリーにおいて、どの残基が触媒残基か全く分かっていなかった。そこで、さまざまな変異酵素を構築し、前年度までで確立した酵母での発現系を用いてこれら酵素を取得し解析した。その結果、353、372、および373番の3つのアスパラギン酸残基が触媒活性に重要な働きを担っていることが判明した。

Research Products

• [Publications] Yopi, T.Tonozuka, H.Sakai, Y.Sakano: "Cloning of a gene cluster for dextrin utilization from Thermoactinomyces vulgaris R-47 and characterizarion of the cyclodextrin-binding protein"J Appl.Glycosci.. 49. 107-114 (2002)
• [Publications] S.Kamitori, A.Abe, A.Ohtaki, A.Kaji, T.Tonozuka, Y.Sakano: "Crystal Structures and Structural Comparison of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-Amylase I (TVAI) at 1.6Å Resolution and α -Amylase II (TVAII) at 2.3Å Resolution"J.Mol.Biol.. 318. 443-453 (2002)
• [Publications] 殿塚隆史, 坂野好幸: "多糖プルランを分解するα-アミラーゼの立体構造とダイマー形成"生化学. 74. 1162-1166 (2002)
• [Publications] T.Tonozuka, T.Yokota, K.Ichikawa, M.Mizuno, S.Kondo, A.Nishikawa, S.Kamitori, Y.Sakano: "Crystal structures and substrate specificities of two α-amylase hydrolyzing cyclodextrins and pullulan from Thermoactinomyces vulgaris R-47"Biologia, Bratislava. 57,Suppl.11. 71-76 (2002)
• [Publications] H.Akeboshi, Y.Kashiwagi, H.Aoki, T.Tonozuka, A.Nishikawa, Y.Sakano: "Construction of an Efficient Expression System for Aspergillus Isopullulanase in Pichia pastoris and a Simple Purification Method"Biosci.Biotechnol.Biochem.. (in press). (2003)