2000 Fiscal Year Annual Research Report
メタノール酵母細胞内動態のビジュアル化とソーティング・エンジニアリング
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12460149
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
阪井 康能 京都大学, 農学研究科, 助教授 (60202082)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 昌之 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助教授 (50212254)
由里本 博也 京都大学, 農学研究科, 助手 (00283648)
加藤 暢夫 京都大学, 農学研究科, 教授 (50026556)
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| Keywords | メタノール資化性酵母 / 異種遺伝子発現系 / Candida boidinii / 細胞内輸送工学 / オルガネラ / ペルオキシソーム |
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| Research Abstract |
メタノール酵母単膜系オルガネラであるペルオキシソームと液胞は細胞内体積の大部分を占めているオルガネラである。我々はメタノール資化性酵母を用いて、強力な異種遺伝子発現系の開発に成功している。我々は細胞内タンパク質動態をビジュアル化することにより、発現させたタンパク質の細胞内動態を知り、それを利用して、タンパク質の機能解析や、従来、発現の困難であった有用タンパク質の生産に取り組んでいる。このような技術をソーティング・エンジニアリングと名付け細胞内輸送工学の中の一技術として位置づけている。本年度は、タンパク質のペルオキシソームへの局在過程の3つの過程についてのビジュアル化、ペルオキシソームの形と数のビジュアル化に成功した。一方、このような研究過程で細胞内容量の30%を占める巨大なオルガネラであるペルオキシソームが液胞に取り込まれて分解されることを見いだし(Y.Sakai et al.,J.Cell Biol.,141,625(1998)オルガネラでの異種タンパク生産性向上を妨げていると考えている。そこで、ペルオキシソームの分解過程については、新たにリアルタイムでビジュアル化することにより、液胞が分断化しながらペルオキシソームを取り囲んでいくことを明らかにした。また、ペルオキシソームにおける有用タンパク質の生産についても、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼだけでなく、アセチルスペルミジンオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼなど、オキシダーゼの生産に一般的にペルオキシソームにおける生産が有効であることを示した。また、ペルオキシソーム内における酸化ストレスを分解する分子として、Pmp20を同定し、世界で初めてPmp20が脂質過酸化物に対してグルタチオンペルオキシダーゼ活性を示すことを生化学的に明らかにする一方、Pmp20を用いたソーティングエンジニアリングにより、Pmp20がメタノールでの生育に必須の分子であり、かつ、ペルオキシソーム内で生体膜を保護している分子であることを明らかにした。
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[Publications] M.Nishikawa et al.: "Primary structure and expression of peroxisomal acetylspermidine oxidase in the methylotrophic yeast Candida boidinii."FEBS Lett.. 476(3). 150-154 (2000)
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[Publications] H.Yurimoto et al.: "Regulation and evaluation of five methanol-inducible promoters in the methylotrophic yeast Candida boidinii."Biochim.Biophys.Acta. 1493(1-2). 56-63 (2000)
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[Publications] 阪井康能: "異種タンパク質生産のための"細胞内輸送工学""生物工学会誌. 78(9). 397-401 (2000)
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[Publications] 阪井康能: "オルガネラ分解戦略としてのオートファジーとその分子機構:メタノール資化性酵母のミクロペキソファジーをモデルとして."実験医学. 19(2). 300-305 (2001)
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[Publications] H.Yurimoto et al.: "Characterization and high-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65(3). 627-633 (2001)
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[Publications] H.Horiguch et al.: "Antioxidant System Within Peroxisome : Biochemical and Physiological Characterization of CbPmp20 in the Methylotrophic Yeast Candida boidinii."J.Biol.Chem.. (In press). (2001)
