メタノール酵母細胞内動態のビジュアル化とソーティング・エンジニアリング

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12460149
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 阪井 康能 京都大学, 農学研究科, 助教授 (60202082)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 昌之 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助教授 (50212254) ; 由里本 博也 京都大学, 農学研究科, 助手 (00283648) ; 加藤 暢夫 京都大学, 農学研究科, 教授 (50026556)
• Keywords: メタノール資化性酵母 / 細胞内輸送工学 / オルガネラ / 蛋白質輸送 / 異種遺伝子発現 / ペルオキシソーム

Research Abstract

1. メタノール資化性酵母におけるオルガネラ動態のビジュアル化と応用機能開発
(1)代謝及び蛋白質輸送機能
メタノール酵母に発達しているペルオキシソーム代謝、特に抗酸化代謝機能に関わる2つの蛋白質、カタラーゼとPmp20について、その生理生化学的機能を明らかにした。特にPmp20については、ペルオキシソームに局在するペルオキシレドキシンとして過酸化脂質を基質としたグルタチオンペルオキシダーゼであることを初めて明らかにし、カタラーゼの持つ抗酸化反応との差異を明確にした(J.Biol.Chem,276,14279)。また、これらの蛋白質のペルオキシソームへの局在化効率には差があることを示し、その差は局在化シグナルとそのレセプターとの相互作用の強さに依存していることがわかった(J.Bacteriol.,183,6372他)
(2)ペルオキシソーム分解の分子機構
ペルオキシソームの発達した細胞をその不要な培地に移すとペルオキシソームが選択的に分解される。この過程を2重蛍光染色法により1細胞で追跡することにより、液胞が分断化しながらペルオキシソームを包み込みこんで行くことを明らかにした。さらにその過程を支配する20以上のPAZ遺伝子を同定しペルオキシソーム分解の分子モデルを提出した(Genes Cells,7,75他)。
(3)蛋白質生産系への開発と応用
蛋白質やペルオキシソーム分解に関わるPEP4及びPRB1遺伝子をCandida boidiniiiからクローニングして高蛋白質生産用の宿主を創生した。さらに臨床診断酵素として有用なペルオキシソーム酵素であるD-アミノ酸オキシダーゼの高生産に成功した(Biosci, Biotechnol.Biochem.,65,627;ibid.,66 628)。
平成13年度に予定されていた本研究は、申請者が基盤研究(S)を受けることになったため、辞退することになった。しかしながら、その決定通知を受け取るより以前の段階において、上記成果を論文発表するための図表作製に必要な消耗品として、本研究費の一部を充当することになった。

Research Products

• [Publications] Nakagawa, T. et al.: "Analysis of Alcohol-Oxidase Isozymes in Gene-Disrupted Strains of the Methylotrophic Yeast Pichia methanolica"Journal of Bioscience and Bioengineering. 91・2. 225-227 (2001)
• [Publications] 阪井康能: "オルガネラ分解戦略としてのオートファジーとその分子機構:メタノール資化性酵母のミクロペキソファジーをモデルとして"実験医学. 19・2. 300-305 (2001)
• [Publications] Yurimoto, H. et al.: "Characterization and high-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 65・3. 627-633 (2001)
• [Publications] Horiguchi, H. et al.: "Antioxidant System within Yeast Peroxisome: Biochemical and Physiological Characterization of CbPmp20 in the Methylotrophic Yeast Candida boidinii"Journal of Biological Chemistry. 276・17. 14279-14288 (2001)
• [Publications] Horiguchi, H. et al.: "Peroxisomal Catalase in the Methylotrophic Yeast Candida boidinii: Transport Efficiency and Metabolic Significance"Journal of Bacteriology. 183・21. 6372-6383 (2001)
• [Publications] Mukaiyama, H. et al.: "Paz2 and 13 oher PAZ gene products regulate vacuolar engulfment of peroxisomes during micropexophagy"Genes to Cells. 7・1. 75-90 (2002)
• [Publications] Komeda, T. et al.: "Construction of Protease-deficient Candida boidinii Strains Useful for Recombinant Protein Production: Cloning and Disruption of Proteinase Agene (PEP4) and Proteinase B gene (PRB1)"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 66・3. 628-631 (2002)
• [Publications] 阪井康能: "細胞内輸送工学:バイオテクノロジーと真核細胞タンパク質輸送機能の接点を探る"バイオサイエンスとインダストリー. 59・11. 797 (2001)
• [Publications] 阪井康能: "「代謝制御醗酵」In"醗酵ハンドブック""共立出版(株). 680(3) (2001)
• [Publications] Yurimoto, H. et al.: ""Methanol metabolism"in"Hansenula polymorpha""Wiley-VCH Verlag、GmbH, Weinheim, Germany(印刷中). (2002)