トリパノソーマ科原虫ピリミジン合成経路の6酵素の全遺伝子と発現タンパク質の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470061
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 青木 孝 順天堂大学, 医学部, 教授 (20053283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 嶋田 淳子 順天堂大学, 医学部, 講師 (20211964) ; 高宮 信三郎 順天堂大学, 医学部, 助教授 (90138206) ; 奈良 武司 順天堂大学, 医学部, 助手 (40276473)
• Keywords: ピリミジンヌクレオチド / 新生合成経路 / pyr遺伝子 / トリパノソーマ / 遺伝子共発現 / 過剰発現 / 遺伝子ノックアウト / RNAi

Research Abstract

ピリミジンヌクレオチドは核酸の構造・機能単位として生命に必須であり、その新生合成(de novo)経路は6段階の酵素反応から成る。6種の酵素はそれぞれの遺伝子(pyr1、pyr2、pyr3、pyr4、pyr5、pyr6)によってコードされ、原核生物では独立のタンパク質あるいはサブユニットとして存在する。これに対して動物では第1-第3-第2および第5-第6酵素はそれぞれ多機能タンパク質として細胞質に局在し、第4酵素はミトコンドリア局在性である。我々は、シャーガス病の病原体Trypanosoma cruziの全pyr遺伝子を同定し、これらの遺伝予は5'-側からpyr1、pyr3、pyr6-5、pyr2、pyr4の順に800kbおよび1000kbの染色体DNA上にpolycistronicな転写ユニットとして存在することを、はじめて明らかにした。本研究では平成12年度に全pyr遺伝子がコードする6酵素の主な特徴を記述し、平成13年度には主として第1〜4酵素についてさらに詳しく解析した。大腸菌を用いて第1酵素をGroEL/ESと共発現させた場合、ウェスタン法で予想される170kDaのバンドが確認されたが発現量は少なく、分解されやすいと考えられた。この系にさらに第2酵素を共発現させたところ、第1酵素の単独発現の場合よりも分解量は低下した。原虫細胞内では第1〜3酵素は非共有結合性の複合体を形成している可能性があるので、おそらく第2酵素の存在が第1酵素を安定化させたものと考えられた。第4酵素については、原虫への遺伝子導入による過剰発現、相同組み換え(ノックアウト)やRNAiによる遺伝子発現抑制の程度を解析し、本酵素の生理的意義や役割を追究している。

Research Products

• [Publications] 奈良武司, 青木 孝: "トリパノソーマのピリミジン生合成遺伝子クラスター"蛋白質 核酸 酵素. 47・1. 13-20 (2002)
• [Publications] 奈良武司, 青木孝他: "Trypanosoma cruziのピリミジン生合成経路第4酵素dihydroorotate dehydrogenaseに対する海草抽出液の阻害効果"第71回日本寄生虫学会大会記録. (2002)
• [Publications] 案浦 健, 青木孝他: "Trypanosoma cruziにおけるピリミジン合成経路第4酵素dihydroorotate dehydrogenase遺伝子のノックアウト株の作製と表現型の解析"第71回日本寄生虫学会大会記録. (2002)