組織切片上の未知の超微量蛋白質同定法の確立と新しいプリオン関連蛋白質同定への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470146
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 金子 清俊 国立精神・神経センター, 神経研究所・疾病研究第七部, 部長 (10251513)
• Keywords: レーザーマイクロダイセクション技術 / scFV(single chain variable fragment) / 組織切片 / in situ phage screening / 微量抗原

Research Abstract

われわれは、レーザーマイクロダイセクション技術と、scFv(single chain variable fragment)ファージ抗体ライブラリーとを組み合わせ、組織切片上(in situ)に存在する極めて微量な抗原を同定する方法論:in situ phage screening(ISPS)法、を開発した。今回は、ヒト筋肉凍結切片をモデル系として行ったISPS法の実際について紹介する。
ヒト筋肉より、凍結切片を作成し、scFvファージライブラリーを反応させた。レーザーマイクロダイセクションにより、この筋肉切片より、40μx40μの微小領域を3枚切りだし、この面積(約5000平方μ)中に存在する、微量抗原に対するscFvファージをセレクションすることを、試みた。延べ300種類あまりのscFvクローンを解析し、38kDaおよび100kDaの未知抗原を特異的に認識する二種類のscFvファージと、アクチン(を含む複数の抗原)を認識する低特異性scFvファージが数種類、得られた。前者の特異的scFvファージを用いて、筋発現ライブラリーのイムノスクリーニングを行ったところ、38、100kDaの未知抗原は、それぞれトロポミオシンα、およびαアクチニン2と同定された。この結果は、2Dゲルから切り出した抗原の、マススペクトロメトリー解析によっても確認された。これらの抗原は、筋切片の当該面積表面においては、存在量は数ピコグラム以下と推定され、本ISPS法により、組織、あるいは病理切片中に存在する、ピコグラムレベルの未知抗原の同定が、可能であると考えられた。

Research Products

• [Publications] K.Kaneko: "A Synthetic Peptide Initiates Gerstmann Straussler-Scheinker (GSS) Disease in Transgenic Mice. Running title : A peptide causes Gerstmann Straussler Scheinker disease"Journal of Molecular Biology. 295. 997-1007 (2000)
• [Publications] Zulianello: "Dominant-negative inhibition of prion formation diminished by deletion mutagenesis of the pric protein."Journal of Molecular Biology. 74. 4351-4360 (2000)
• [Publications] V.Perrier: "Mimicking dominant negative inhibition of prion replication through structure based drug design."Proceedings of the National Academy of Science U.S.A.. 97. 6073-6078 (2000)
• [Publications] C.Korth: "Expression of unglycosylated mutant prion protein facilitates PrP^<Sc> formation in neuroblastoma infected with different prion strains."Journal of General Virology. 81. 2555-2563 (2000)