2001 Fiscal Year Annual Research Report
組織切片上の未知の超微量蛋白質同定法の確立と新しいプリオン関連蛋白質同定への応用
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12470146
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
金子 清俊 国立精神・神経センター, 疫病研究第七部, 部長 (10251513)
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| Keywords | レーザーマイクロダイセクション / scFv(single chain variable fragment) / 組織切片 / in situ phage screening / 微量抗原 |
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| Research Abstract |
われわれは、レーザーマイクロダイセクション技術と、scFv(single chain variable fragment)ファージ抗体ライブラリーとを組み合わせ、組織切片上(in situ)に存在する極めて微量な抗原を同定する方法論: in situ phage screening(ISPS)法、を開発した。昨年度は、ヒト筋肉凍結切片をモデル系として行ったISPS法の実際について紹介した。その詳細は、レーザーマイクロダイセクション技術により、ヒト筋肉より凍結切片を作成し、約5000平方μ中に存在する微量抗原に対するscFvファージをセレクションすることを試みた。延べ300種類あまりのscFvクローンを解析し、38kDaおよび100kDaの未知抗原を特異的に認識する2種類のscFvファージと、アクチン(を含む複数の抗原)を認識する低特異性scFvファージが数種類得られた。特異的scFvファージを用いて、筋発現ライブラリーのイムノスクリーニングを行ったところ、トロポミオシンα、およびαアクチニン2が同定された。この結果は、2Dゲルから切り出した抗原の、マススペクトロメトリー解析によっても確認された。現在、本方法を各種疾患に応用しそれぞれの疾患特異的な臓器沈着物質の同定を試みている。また、近年とりわけ著しい進展が見られる質量分析計(MALDI-TOF MS/MS)を応用し、レーザーマイクロダイセクションシステムと組み合わせた新しい微量分析法の開発も検討中である。予備実験の結果では、ファージ抗体ライブラリーとを組み合わせた方法以上の高感度が期待できる可能性が示唆されている。
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[Publications] K.Kaneko: "A Synthetic Peptide Initiates Gerstmann-Straussler-Scheinker(GSS) Disease in Transgenic Mice. Running title : A peptide causes Gerstmann Straussler Scheinker disease"Journal of Molecular Biology. 295. 997-1007 (2000)
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[Publications] Zulianello: "Dominantnegative inhibitionof prion formation diminished by deletion mutagenesis of the prio protein"Journal of Molecular Biology. 74. 4351-4360 (2001)
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[Publications] V.Perrier: "Mimicking dominant negativenhibition of prion replication through structurebased drug design"Proceedings of the National Academy of Science.U.S.A.. 97. 6073-6078 (2000)
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[Publications] C.Korth: "Expression of unglycosylated mutant prion protein facilitates PrP^<Sc> formation in neuroblastoma infected with different prion strains"Journal of General Virology. 81. 2555-2563 (2001)
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[Publications] Peretz D: "Antibodies inhibit prion propagation and clear cell cultures of prion infectivity"Nature. 412. 739-743 (2001)
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[Publications] Laws DD: "Sokid-state NMR studies of the secondary structure of a mutant prion protein fragment of 55 residues that induces neurodegeneration"Proc Natl Acad Sci USA. 98. 11686-11690 (2001)
