体外肝組織再構築と組織移植による肝不全治療法の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470243
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 望月 洋一 札幌医科大学, 附属がん研究所, 教授 (40045381)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小島 隆 札幌医科大学, 医学部, 講師 (30260764) ; 三高 俊広 札幌医科大学, 附属がん研究所, 助教授 (50231618) ; 平田 公一 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50136959) ; 竹田 寛 札幌医科大学, 附属がん研究所, 助手 (00333310)
• Keywords: 小型肝細胞 / 幹細胞 / 骨髄間葉細胞 / 成熟化 / 細胞外基質 / scaffold / ヒト肝細胞 / 凍結保存

Research Abstract

我々は、成熟ラット肝臓より肝幹細胞の一種と考えられる小型肝細胞を分離培養し、増殖と成熟肝細胞への分化を調節する方法を見いだした。小型肝細胞は増殖しコロニーを形成し、非実質細胞、特に星細胞の分泌する細胞外基質が小型肝細胞の周りに蓄積することよって成熟化し、3次元的な類肝組織を形成する。立体構造構築には、基底膜の形成が必要であり、小型肝細胞の成熟化は、非実質細胞などが分泌している増殖因子によるというよりも分泌された細胞外基質による誘導と考えられた。このことは、非実質細胞の増殖が抑制されると小型肝細胞の増殖が促進されるという結果とも一致する。分化誘導を受けた小型肝細胞は、培養後、数週間経過しているにも関わらず、成熟肝細胞が豊富に発現している転写因子のHNF4,HNF6,C/EBPalphaなどを強く発現するようになり、それら転写因子によって発現調節されているアルブミン、トランスフェリンばかりではなく、尿素合成に必要なCarbamoyl-phosphate synthetase Iやアンモニア代謝に必要なGlutamine synthetaseが発現するようになり、薬物代謝のCytochrome P450の誘導がかかるようになる。この結果は、成熟化した小型肝細胞が生体内の肝細胞と同等な機能を発揮できるということである。小型肝細胞はコロニーの状態での長期間の凍結保存(液体窒素を使うことなく-80°Cで良い)が可能で、最長90週凍結保存した小型肝細胞を増殖させることに成功した。平均60%の生着率で生着した小型肝細胞は増殖する。2週間でコロニーの面積にして約7倍に、アルブミンの産生は約5倍になる。凍結保存した小型肝細胞も成熟化を誘導することが可能であった。
ヒト肝細胞を分離し、小型肝細胞の増殖を認め、一部にラットで見られるような立体構造をとる可能性を認めた。また、ヒト肝細胞をコラーゲンからなるscaffoldの中で培養すると胆管上皮の形成が誘導され、その下で成熟肝細胞が3次元的構造を形成しつつ長期間生存した。scaffoldの中では、胆管や毛細血管の形成が認められた。
また、ラット骨髄から間葉系細胞を分離培養し、初代培養肝細胞と共培養すると小型肝細胞の増殖が促進され、成熟肝細胞の分化能の維持に良いことが分かった。

Research Products

• [Publications] 三高俊広: "肝臓における幹細胞システムと肝組織構築(総説)"実験医学. 18(4). 431-437 (2000)
• [Publications] Toru Mizuguchi: "Paper is compatible bed for rat hepatocytes"Artificial Organs. 24(4). 271-277 (2000)
• [Publications] Masato Isobe, et al.: "Role of inducible nitric oxide synthetase on hepatic ischemia and reperfusion injury"Transplantation Proceedings. 32(7). 1650-1652 (2000)
• [Publications] Tadashi Katsuramaki, et al.: "Changes in hepatic venous oxygen saturation in hepatic warm ischemia/reperfusion injury in pigs"Surgery Today. 30(4). 343-351 (2000)
• [Publications] Minoru Nagayama, et al.: "Changes in hepatic microdialysate uric acid levels in porcine liver ischemia/reperfusion"Transplantation Proceedings. 32(7). 2282-2284 (2000)
• [Publications] Tadashi Katsuramaki, et al.: "Different changes of endothel in-1 after reperfusion in a warm ischemia/reperfusion and transplantation model in pig liver"Transplantation Proceedings. 32(7). 2276-2278 (2000)
• [Publications] 三高俊広: "肝臓の再生(総説)"肝胆膵. 42(2). 195-201 (2001)
• [Publications] Takashi Kojima et al.: "Occludin and claudin-1 concerntrate in the midbody of immortalzed mouse hepatocytes during cell division"Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49(3). 333-340 (2001)
• [Publications] Takashi Kojima. et al.: "Cx32 but not Cx26 is associated with tight junctions in primary cultures of rat hepatocytes"Experimental Cell Research. 263(2). 193-201 (2001)
• [Publications] Koichi Hirata, et al.: "Sepsis and cholestasis : basic findings in the sinusoid and bile canaliculus. (Review)"Journal of Hepatobiliary Pancreatic Surgery. 8(1). 20-26 (2001)
• [Publications] Toshihiro Mitaka, et al.: "Hepatic Stem Cells ; From Bone Marrow to Hepatocytes (Review)"Bicohemical and Biophysical Research Communication. 281(1). 1-5 (2001)
• [Publications] 三高 俊広, 他: "肝臓の幹細胞(総説)"Molecular Medicine. 38(1). 8-15 (2001)
• [Publications] 三高俊広, 他: "肝臓の幹細胞kステム(総説)"GI Research. 19(3). 229-234 (2001)
• [Publications] Nagato Higaki et al.: "Maitenance of connexin 32 and 26 expression in primary cultured rat hepatocytes treated with 3-acetylpyridine"Journal of Gastroenterology and Hepatology. 16(7). 806-815 (2001)
• [Publications] Toru Mizuguchi, et al.: "Regulation of c-met expression in rats with acute hepatic failure"Journal of Surgical Research. 99(2). 385-396 (2001)
• [Publications] Toru Mizuguchi et al.: "Enhanced proliferation and differentiation of rat hepatocytes cultured with bone marrow stromal cells"Journal of Cellular Physiology. 189(1). 106-109 (2001)
• [Publications] Toshihiro Mitaka, et al.: "Expression of carbamoylphosphate synthetase 1 and glutamine synthetase in hepatic organoids reconstructed by rat small hepatocytes and hepatic nonparenchymal cells"Cell and Tissue Research. 306(3). 467-471 (2001)
• [Publications] Toru Mizuguchi et al.: "Effects of bone marrow stromal cells on the structural and functional polarity of primary rat hepatocytes"In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal. (in press). (2002)
• [Publications] 三高俊広: "動き出した再生医療の臨床〜肝臓〜"分子細胞治療. 1(1). 78-85 (2002)
• [Publications] Nagato Katsura et al.: "Long-term culture of primary human hepatocytes with preservation of proliferative capacity and differentiated functions"Journal of Surgical Research. (in press). (2002)
• [Publications] Shinichiro Ikeda, et al.: "Proliferation of rat small hepatocytes after long-term cryopreservation"Journal of Hepatology. (in press). (2002)
• [Publications] Toshihiro Mitaka, et al.: "The Hepatocyte Review : Chapter 14"Kluwer Academic Publishers (Dordrecht, The Netherlands). 624 (2000)
• [Publications] 池田慎一郎, 他: "幹細胞・クローン研究プロトコール:第5章 肝前駆細胞からの増殖と分化:小型肝細胞(small hepatocyte)の分離方法"羊土社、東京. 254 (2001)