Etsがん遺伝子群転写因子E1AFの細胞周期調節機構の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470431
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 戸塚 靖則 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (00109456)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安田 元昭 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (90239765) ; 東野 史裕 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (50301891) ; 進藤 正信 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教授 (20162802) ; 小林 正伸 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教授 (80241321)
• Keywords: E1AF / p53 / 細胞周期調節

Research Abstract

p2lwaf1/cip1の転写調節領域にはp53の結合部位が存在し、p53により転写活性化されることが知られているが、これに加えてp53結合部位の近傍にETS結合部位が存在していることを我々は見いだした。そこで、p53の欠失しているヒト肺がん細胞株H1299に、レポーターとしてp21waf1/cip1プロモーターを持つレポータープラスミド(P21Pr.-Luc)、エフェクターとして野生型p53とE1AFの発現ベクターをコトランスフェクションし、24時間後、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、E1AFとp53は相乗的にp21遺伝子の転写を活性化することが証明された。
In Vitroで作成したHA-E1AFとp53を混合し、抗HA抗体を用いて免疫沈降を行い、それらのサンプルをp53抗体でウエスタンブロットした結果、E1AFとp53はin vitroでの結合が認められた。H1299細胞に、HA-E1AFとp53の発現ベクターをコトランスフェクションし免疫沈降およびウエスタンブロットを行ったところ、in vivoでの両タンパクの結合が証明された。
E1AFのTumor Suppressorとアポトーシス誘導能について検索した。マウスNIH3T3細胞に、アデノウイルス5型のE1A遺伝子と活性型ras遺伝子の発現ベクターをコトランスフェクションし、それと同時にp53とE1AF(pCMVE1AF)の発現ベクターを導入しそれらの遺伝子のTumor suppressor活性を調べた。その結果E1AFを導入したディッシュではp53を入れた物と同様、コロニーの数が減少し、E1AFにはTumor suppressor活性のあることが示された。しかし、Saos-2細胞を用いてGrowth Suppression Assayを行った結果、E1AFはアポトーシス誘導能は持たないことが示された。
以上の結果より、E1AFは野生型p53と共同で細胞周期を調節することにより細胞のがん化を抑制することが考えられた。