局所麻酔薬のNaイオンチャネルに対する直接作用の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470447
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 國分 正廣 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (70124691)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小田 和明 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (80094829)
• Keywords: Naイオンチャネル / 膜タンパク / ボルテージクランプ / ショ糖勾配法

Research Abstract

本年度は超高速遠心機を用いて、ラットの脳から生物学的活性を保ったままNaイオンチャネルを分離精製することを目的とした。ラットの全脳を氷冷した0.32M sucroseと4種のプロテアーゼ阻害剤(4PI,0.1mMフェニールメタンスルホニルフルオイド,1mMヨードアセトアミド,1mM o-フェナントロリン,1μMペプスタチンA)を含む5mM tris HCl buffer中で、ハサミで細片としたのち、ポッター型ガラス-テフロンホモジナイザーで外側を冷やしながら10往復ホモジナイズした。700gで10分間遠心して、得られた上清を27,000gで20分間遠心して、沈査(P_3)を得た。P_3を1mM EDTAと4PIを含む5mM tris HCl bufferに懸濁し、氷中に15分間静置して、低張破壊した後、27,000g、40分間遠心して得られたペレット(破壊P_3)を200mM KCl,と4PIを含む10mM HEPES tris HCl bufferに懸濁してsynaptosome分画とした。このNaチャネルを含むsynaptosome分画を界面活性剤Nonidet P-40を用いて可溶化し、この後120,000gで50分間遠心して上清を集めて、可溶化Naイオンチャネル標品とした{synaptosome(神経終末)分画、ミトコンドリア、破壊細胞膜を含む}。また、サンプルはNonidet P-40の影響を除くため、0℃下に一中夜、透析した。その後、Sepharose-6Bを用いてゲル濾過したのち、ショ糖勾配遠心法では0℃下に40%sucroseと20%sucroseを加え、100,000gで90分間遠心分離して、可溶化Naイオンチャネルを得た。この時の蛋白濃度は1.7mg/mlであり、ほぼ予測どうりの生物学的活性を保ったNaイオンチャネルが得られた。今後はリン脂質膜に組み込んでその解析を行なう。