2001 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトのリソソーム病に関わる糖代謝酵素のX線結晶構造解析による構造生物学的研究
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12470486
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐藤 能雅 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (30150014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水谷 隆太 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482)
野口 修治 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (60237823)
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| Keywords | リソソーム病 / ファブリー病 / α-ガラクトシダーゼ / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 遺伝子変異 / 先天性代謝異常症 / 遺伝病 |
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| Research Abstract |
ファブリー病は,α-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子変異が酵素活性の低下をもたらし,心臓などに糖セラミドが蓄積して障害を生ずる先天性代謝異常症である。同様に,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの遺伝子変異によりシンドラー病・神崎病が発症する。研究では,これらリソソーム病に関わるヒトα-ガラクトシダーゼ,その変異体とα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの三次元構造をX線結晶構造解析で明らかにし,病態の理解を深めることを目的とする。
研究の2年度として,α-ガラクトシダーゼについて,酵素活性の低下をもたらす遺伝子変異が導入された病態酵素のタンパク質3種を発現させ,高純度試料の大量調製,結晶化,X線回折強度の測定と三次元構造の解析を行った。まず,構築した高発現系を用いて変異体を調製し,アスパラギン結合型の糖鎖を酵素処理によって均一に短糖鎖化した。調製した変異体について,分子の会合状態,活性,安定性などの性状解析を行った。X線解析では,基質類似阻害剤のデオキシガラクトノジリマイシンとの複合体の結晶を調製し,先に解析した正常体の結晶構造を利用して変異体の詳細な三次元構造を得ることができた。亜型のファブリー病を発症する変異体2種では,正常体と僅かな三次元構造差異しか示さないが酵素の安定性は低下し,致命的な古典型の変異体では,変異したアミノ酸残基の側鎖が活性部位を覆って基質の結合を妨害し,酵素の活性を完全に喪失させることが判明した。
ヒトα-N-アセチルガラクトサミニダーゼについては,高発現株を用いて,精製,短糖鎖化,結晶化を行った。しかし,得られた結晶は微小であり,X線解析にはいたっていない。良好な結晶が得られるならば,既に得たα-ガラクトシダーゼの結晶構造を活用する分子置換法が適用でき,直ちに三次元構造が得られることから,結晶サイズの改善を続ける計画である。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Ken Murase, Ryuta Mizutani, Yoshinori Satow: "Expression, characterization and crystallization of the Fv fragment of mouse antibody 3B62 from the secondary immune response"Acta Crystallographica. D57. 1703-1705 (2001)
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[Publications] Ryuta Mizutani, Shunsuke Miyamoto, Yoshinori Satow: "Mechanism of catalytic reaction by yeast VMA1 endonuclease"SPring-8 Experiment Report. 7. 154-154 (2001)
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[Publications] H.Yokoyama, R.Mizutani, Y.Satow, K.Sato, Y.Komatsu, E.Ohtsuka, O.Nikaido: "Crystal structure of DNA(6-4)photoproduct dTT(6-4)TT in complex with the 64M-2 antibody Fab fragment implies increased antibody-binding affinity by the flanking nucleotides"Acta Crystallographica. D58(印刷中). (2002)
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[Publications] R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y.Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Protein-splicing reaction via a thiazolidine intermediate : Crystal structure of the VMA1-derived endonuclease bearing the N and C-terminal propeptides"J.Mol.Biol.. (印刷中). (2002)
