HIV-TatとRNAアプタマーの複合体の立体構造決定に基づくドラッグデザイン

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470487
• Research Institution: Yokohama National University
• Principal Investigator: 片平 正人 横浜国立大学, 大学院・環境情報研究院, 助教授 (70211844)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上杉 晴一 横浜国立大学, 大学院・環境情報研究院, 教授 (70028851)
• Keywords: トリプレットリピート / リボザイム / ダナミクス / テロメア / 4重鎖 / 安定同位体標識 / 水素結合 / RNA結合タンパク質

Research Abstract

RNAアプタマーの研究により、^<13>C,^<15>N標識を生かしたRNAの構造解析のノウハウが確立された。そこでこれを生かして、RNAリボザイム(HDVリボザイム)の切断メカニズムの解明を試みた。その結果切断に必須な金属イオン(マグネシウムイオン)の位置や、切断反応において遷移状態に移行する際の構造変化を同定する事ができた。またRNAの解析で得られた同位体標識技術をDNAにも拡張し、GGAのトリプレットリピートからなるDNAが、非常に特異な平行型の4重鎖構造を形成する事を明らかにした。一方RNAアプタマーTatタンパク質の研究からは、タンパク質のダイナミクスを解析するノウハウも得られた。そこでテロメア配列のRNA及びDNAに結合するタンパク質hnRNPDに対してこれを適用した。その結果、このタンパク質は、単体の時にはミリ秒の時間オーダーで揺らぎながら標的核酸を探索しているが、ひとたび標的を見出すと、誘導適合を生じながら、揺らぎのない強固な複合体を形成する事が分かった。
RNAアプタマーは、Tatタンパク質を結合する際に、Tatタンパク質のアルギニンに富んだ領域に存在する2個のアルギニン残基を同時に結合する事が、これまでの研究から強く示唆された。またこの2つのアルギニン残基は、1次配列上連続したものではなく、数残基のスペーサーにより隔てられたものである,事も示唆された。そこで、Tatタンパク質中以上の条件を満たす部分を抽出し、それを含む5残基程度のペプチドを合成し、RNAアプタマーとの結合能を調べて見る事にした。これにより、RNAアプタマーによるTatタンパク質の捕捉機構に関して、これまでの研究から導かれた我々の作業仮説を、直接的に検証する事ができる。現在10種のペプチドの合成を終え、結合定数の決定を進行させている。

Research Products

• [Publications] K.Yasuno, T.Yamazaki, Y.Tanaka, T.Kodama, A.Matsugami, M.Katahira, A.Ishihama, Y.Kyogoku: "Interaction of C-terminal domain of the E. coli. RNA polymerase ♯alpha♯ subunit with the UP element : recognizing the backbone structure in minor groove surface"J. Mol. Biol.. 306. 213-215 (2001)
• [Publications] M.katahira, Y.Miyanoiri, Y.Enokizono, G.Matsuda, T.Nagata, F.Ishikawa, S.Uesugi: "Structure of the c-terminal RNA-binding domain of hnRNP D0 (AUF1), its interactions with RNA and DNA, and change in backbone dynamics upon complex formation with DNA"J. Mol. Biol.. 311. 973-988 (2001)
• [Publications] A.Matsugami, K. Ouhashi, M.Kanagawa, H.Liu, M.Kanagawa, S.Uesugi, M.Katahira: "An intramolecular quadruples of (GGA) $4$ triplet repeat DNA with a G:G:G:G tetrad and a G(:A):G(:A):G(:A):G heptad, and its dimeric interaction"J. Mol. Biol.. 313. 255-269 (2001)
• [Publications] A.Matsugami, K.Ouhashi, M.Kanagawa, H.Liu, M.Kanagawa, S.Uesugi, M.Katahira: "New quadruplex structure of GGA triplet repeat DNA -an intramolecular quadruplex composed of a G:G:G:G tetrad and a G(:A):G(:A):G(:A):G heptad, and its dimerization"Nucleic Acids Res. Suppl.. 1. 271-272 (2001)
• [Publications] Y.Tanaka, T.Hori, H.Tagaya, T.Sakamoto, Y.Kurihara, M.Katahira, S.Uesugi: "Imino proton NMR analysis of HDV ribozymes : nested double pseudoknot structure and Mg!2+! ion binding site close to the cataltic core in solution"Nucleic Acids Res.. 30. 766-774 (2002)
• [Publications] 片平正人: "GGAトリプレットDNAが形成する特異な高次構造とその生物学的な意義"蛋白質・核酸・酵素. 47. 139-144 (2002)
• [Publications] 片平正人: "RNA結合タンパク質及び機能性RNAの機能発現メカニズムに立体構造から迫る-hnRNP D (AUF1), Musashi, Tatアプタマー-"生体の科学. 53. 117-123 (2002)
• [Publications] Y.Tanaka, M. Tagaya, T.Hori, T.Sakamoto, Y.Kurihara, M.Katahira, S.Uesugi: "Cleavage reaction of HDV ribozymes in the presence of Mg!2+! is accompanied by a conformational change"Genes to Cells. (in press). (2002)