2000 Fiscal Year Annual Research Report
複製前複合体形成の試験管内再構成系の確立とその制御機構の解明
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12470499
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
水島 徹 岡山大学, 薬学部, 助教授 (00264060)
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| Keywords | ORC / ORC / DNA複製 / ATPase / DnaA / 酸性リン脂質 / 機能ドメイン / 結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
1 DnaAのX線結晶構造解析
DnaA蛋白質の機能を統合的に理解するために、DnaAのX線結晶構造解析を試みている。結晶化のためには、高い濃度の精製標品が必要である。これまでの精製法では、高い濃度の精製標品を得ることは出来なかったが、これまでのゲル濾過カラムの代わりに、イオン交換カラムを用いることによりそれが可能になることを見出した。
2 DnaAの膜結合部位の決定
我々は既に、DnaAの活性制御に重要な膜結合性の最初の必須アミノ酸として、Lys372を報告している。本年度は、さらに別の必須アミノ酸Arg328を同定した。さらに我々はこれまで未解明であった膜リン脂質によるDnaAからのADP遊離促進機構として、膜リン脂質が、上記の二つのアミノ酸と結合し、その付近の高次構造を変化させ、ADPとの結合に重要な、Arg334がADPと結合できなくするというモデルを提唱した。
3 ORC及びCdc6pのATPaseの役割に関する遺伝学的解析
私は、これまで未解明であったORC及びCdc6pのATPaseの役割を、生化学的に示唆した。このことに遺伝学的支持を与えるためには、ORC及びCdc6pのATPaseの欠損変異蛋白質を構築し、その細胞内での機能を調べる必要がある。私は既に、この変異蛋白質の構築に成功している。そして最近この変異蛋白質の細胞内での発現を制御できるシステムの構築に成功した。
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[Publications] Makise,M.: "Identification of amino acids involved in the functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids."J.Biol.Chem.. 275. 4513-4518. (2000)
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[Publications] Mizushima,T: "Site-directed mutational analysis of DnaA protein, the initiator of chromosomal DNA replication in E.coli."J.Biochem.(review). 127. 1-7 (2000)
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[Publications] Mizushima,T: "Cdc6p modulates the structure and DNA binding activity of the Origin Recognition Complex in vitro."Genes & Dev.. 14. 1631-1641. (2000)
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[Publications] Kondo,T.: "Suppression of temperature-sensitivity of a dnaA46 mutant by higher DNA supercoiling"Biochem.J.. 348. 375-379 (2000)
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[Publications] Tomisato,W.: "Geranylgeranylacetone protect sultured guinea pig gastric mucosal cells from cytotoxic effect of indomethacin."Dig.Dis.Sci.. 45. 1674-1679 (2000)
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[Publications] Makise,M.: "Molecular mechanism for functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids ; identification of important amino acids"J.Biol.Chem.. (In press). (2001)
