新規キノン型ビルトイン補酵素の構造と触媒機能及び生合成機構

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480180
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (10247968) ; 黒田 俊一 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (60263406)
• Keywords: キノン型補酵素 / 銅アミン酸化酵素 / 銅イオン / トパキノン / ビルトイン補酵素 / X線結晶解析

Research Abstract

種々のアミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する銅アミン酸化酵素は、新規なキノン型ビルトイン補酵素、トパキノン(TPQ)を含有している。このTPQ補酵素は、酵素タンパク質中の特定のチロシン残基が翻訳後修飾を受けて生成する。私どもはこれまでに、TPQの生成が2価銅イオンと分子状酸素の存在下で起こる自触的反応であることを明らかにした。さらに、細菌の銅アミン酸化酵素のX線結晶解析を行い、銅イオンとTPQをともに含まない前駆体型アポ酵素とTPQ含有活性型ホロ酵素の構造を決定した。その結果、アポ酵素とホロ酵素の構造には大きな違いはほとんどないが、いくつかの活性部位残基の位置や向きが大きく異なっていることが明らかになった。また、銅アミン酸化酵素の触媒反応は、基質アミンによるトパキノンの還元反応と分子状酸素による還元型トパキノンの再酸化反応の2つの半反応からなるping-pong機構で進行する。本年度は、本酵素の触媒反応における銅イオンの役割を明らかにするため、Co^<2+>及びNi^<2+>置換型酵素を調製し、反応速度論的・分光学的解析を行った。Cu^<2+>型酵素では、反応の律速段階は還元的半反応にあるが、Co^<2+>及びNi^<2+>型酵素ではトパキノンへの再酸化反応の速度が顕著に低下しており、律速段階は酸化的半反応にあった。また、Co^<2+>及びNi^<2+>型酵素における酸化的半反応過程を分光学的に解析したところ、イミノキノン中間体と考えられる吸収が観察された。金属置換型酵素のX線結晶構造解析の結果と併せて、銅イオンは本酵素の酸化的半反応においてイミノキノン中間体の加水分解過程に必須の役割を担うと推定した。一方、新規なキノヘムタンパク質アミン脱水素酵素に含まれるTTQ様補酵素の構造や生成機構を明らかにすることを目的として、酵素遺伝子のクローニングを行った。その結果、Fe-Sクラスターを含有するタンパク質が本酵素サブユニット遺伝子の近傍にコードされていることが判明し、補酵素の生成に関与すると推定された。

Research Products

• [Publications] N.Nakagawa,M.Hoshijima,M.Oyasu,N.Saito,K.Tanizawa,and S.Kuroda: "ENH, containing PDZ and LIM domain, heart/skeletal muscle-specific protein, associates with cytoskeletal proteins through the PDZ domain."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 272. 505-512 (2000)
• [Publications] T.Koyanagi,K.Matsumura,S.Kuroda,and K.Tanizawa: "Molecular cloning and heterologous expression of pea seedling copper amine oxidase."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 717-712 (2000)
• [Publications] O.Niwa,R.Kurita,K.Hayashi,T.Horiuchi,K.Torimitsu,K.Maeyama.and K.Tanizawa: "Continuous measurement of histamine from rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3) with an on-line sensor using histamine oxidase."Sensors and Actuators. B67. 43-51 (2000)
• [Publications] C.Ogino,Y.Negi,H.Daido,M.Kanemasu,A.Kondo,S.Kuroda,T.Tanizawa,N.Shimizu,and H.Fukuda: "Identification of novel membrane-bound phospholipase D from Streptoverticillium cinnamoneum, possessing only hydrolytic activity."Biochem.Biophys.Acta. 1530. 23-31 (2001)
• [Publications] K.Tanizawa,M.Kusunoki,and T.Fukui: "UDP-Glucose pyrophosphorylase : primary structure and affinity labeling."J.Biochem.Mol.Biol.Biophys.. 4. 1-16 (2001)
• [Publications] T.Yamada,H.Iwabuki,T.Kanno,H.Tanaka,T.Kawai,H.Fukuda,A.Kondo,M.Seno,K.Tanizawa,and S.Kuroda: "Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1+pre-S2+S) protein."Vaccine. (In press). (2001)
• [Publications] 後藤祐児,谷澤克行(編): "バイオサイエンスの新世紀3タンパク質の分子設計"共立出版株式会社. 201 (2001)