2002 Fiscal Year Annual Research Report
新規キノン型ビルトイン補酵素の構造と触媒機能及び生合成機構
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12480180
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (10247968)
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| Keywords | キノン型補酵素 / 銅アミン酸化酵素 / アミン脱水素酵素 / トパキノン / ビルトイン補酵素 / X線結晶解析 / キノヘムプロテイン |
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| Research Abstract |
本研究では、最近相次いで発見されているペプチド・ビルトイン型のキノン補酵素を含有する酵素の構造と機能を明らかにするとともに、タンパク質翻訳後修飾によるキノン型ビルトイン補酵素の生合成機構を解明することを目的としている。ペプチド・ビルトイン型補酵素は、ビタミン由来の補酵素と異なり、タンパク質を構成するアミノ酸残基が特異的な翻訳後修飾を受けて生成する。ビルトイン型補酵素を形成するためにタンパク質はさまざまな戦略を用いている。本年度は、銅アミン酸化酵素に含まれるビルトイン型補酵素の一種、トパキノン(TPQ)が銅イオン依存的に自動的に生成する過程を時間分割X線結晶解析により追跡し、その過程における活性部位の構造変化を明らかにした。具体的には、まず厳密な嫌気条件下でアポ酵素の結晶を作製し、嫌気条件を保ったまま銅イオンを加えた。この結晶を液体窒素温度で凍結し、銅イオンを結合しただけのTPQ生成の第一段階の構造として解析を行った。次いで、結晶を好気的な(酸素を含む)緩衝液に移すことによりTPQ生成反応を開始させ、一定時間毎に結晶を凍結した。これらの結晶についてデータ取得と解析を行った結果、期待通りTPQ生成途上の2つの中間体の構造を決定することに成功した。これは、タンパク質の翻訳後修飾過程の構造変化を明らかにした初めての例である。一方、銅アミン酸化酵素における結合銅イオンの触媒機能に果たす役割を解明するため、コバルトやニッケルで置換した金属置換型酵素を作成し、分光学的解析とX線結晶解析を行った。その結果、結合金属イオンは、本酵素の触媒反応のうち酸化的半反応過程において、パーオキシドやスーパーオキシドを結合し、それらの分子種をプロトン化して過酸化水素として遊離するのに重要な役割を担うことが明らかになった。
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[Publications] S.Kishishita, T.Okajima, M.Kim, H.Yamaguchi, S.Hirota, S.Suzuki, S.Kuroda, K.Tanizawa, M.Mure: "Role of Copper Ion in Bacterial Copper Amine Oxidase : Spectroscopic and Crystallographic Studies of Metal-substituted Enzymes"J.Am.Chem.Soc.. 125. 1041-1055 (2003)
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[Publications] T.Kanno, T.Yamada, H.Iwabuki, H.Tanaka, S.Kuroda, K.Tanizawa, T.Kawai: "Size Distribution Measurement of Vesicles by Atomic Force Microscopy"Anal.Biochem.. 309. 196-199 (2002)
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[Publications] X.Zhang, S.Kuroda, D.Carpenter, I.Nishimura, C.Soo, R.Moats, K.Iida, E.Wisner, F.-Y Hu, S.Miao, S.Beanes, C.Dang, H.Vastardis, M.Longaker, K.Tanizawa, N.Kanayama, N.Saito, K.Ting: "Craniosynostosis in Transgenic Mice Overexpressing Nell-1"J.Clin.Invest.. 110. 861-870 (2002)
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[Publications] T.Okajima, D.Kitaguchi, K.Fujii, H.Matsuoka, S.Goto, S.Uchiyama, Y.Kobayashi, K.Tanizawa: "Novel Trimeric Adenylate Kinase from an Extremely Thermoacidophilic Archaeon, Sulfolobus solfataricus : Molecular Cloning, Nucleotide Sequencing, Expression in Escherichia coli, and Characterization of the Recombinant Enzyme"Biosci.Biotech.Biochem.. 66. 2112-2124 (2002)
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[Publications] M.Kim, T.Okajima, S.Kishishita, M.Yoshimura, A.Kawamori, K.Tanizawa, H.Yamaguchi: "X-ray Snapshots of Quinone Cofactor Biogenesis in Bacterial Copper Amine Oxidase"Nature Struct.Biol.. 9. 591-596 (2002)
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[Publications] S.Iwaki, M.Ogasawara, R.Kurita, O.Niwa, K.Tanizawa, Y.Ohashi, K.Maeyama: "Real-time Monitoring of Histamine Released from Rat Basophilic Leukemia (RBL-2H3) Cells with a Histamine Microsensor Using Recombinant Histamine Oxidase"Anal.Biochem.. 304. 236-243 (2002)
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[Publications] R.Kurita, K.Hayashi, T.Horiuchi, O.Niwa, K.Maeyama, K.Tanizawa: "Differential Measurement with a Microfluidic Device for the Highly Selective Continuous Measurement of Histamine Released from Rat Basophilic Leukemia Cells (RBL-2H3)"Lab Chip. 2. 34-38 (2002)
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[Publications] A.Satoh, J.K.Kim, I.Miyahara, B.Devreese, I.Vandenberghe, A.Hacisalihoglu, T.Okajima, S.Kuroda, O.Adachi, J.A.Duine, J.Van Beeumen, K.Tanizawa, K.Hirotsu: "Crystal Structure of Quinohemoprotein Amine Dehydrogenase from Pseudomonas putida. Identification of a Novel Quinone Cofactor Encaged by Multiple Thio-Ether Cross-Bridges"J.Biol.Chem.. 277. 2830-2834 (2002)
