2001 Fiscal Year Annual Research Report
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12480184
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉腰 雅忠 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (10277254)
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| Keywords | 高度好熱菌 / 進化工学 / 低温適応 / (酵素の)耐熱性 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ |
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| Research Abstract |
本研究計画は、高温下に高い触媒活性と構造安定性を持つ高度好熱菌由来の酵素を、実験室内進化により常温に適応させ、その際どのような構造変化が必要か、また、熱安定性と触媒活性の間の相関関係を明らかにすることを目的としている。モデル酵素として、高度好熱菌Thermus thermophilusが生産するロイシン生合成系の酵素の一つであるイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼを選んだ。高度好熱菌由来の本酵素は高温下に高い活性を示し、また、90度Cまで安定であるが、常温では活性が低い。この酵素をコードしている遺伝子leuBを分離し、この遺伝子を用いてleuBを欠損している大腸菌変異株を形質転換した。形質転換株は、ロイシンを欠く培地では、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼが大腸菌の培養温度では低い活性しか示さないため、あまり活発に増殖できない。好熱菌由来のleuBにPCR法により無作為に変異を与えておき、それを用いて形質転換すると、変異したleuBを発現している大腸菌の中に活発に増殖するものが現れる。これを選択して、leuBを単離し、塩基配列を決定した。また、それらの遺伝子を発現させ、変異しているイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼを単離精製し、その触媒としての性質、および耐熱性を解析した。このやり方で、多数の変異酵素を取得し、解析した。その結果、常温適応は、活性中心以外の部位におこる変異によりもたらされること、適応は反応速度を改善するか、基質との親和性を改善するかどちらかのものが多いが、まれにその両方を改善する変異体も存在しうることを見出した。常温適応した酵素には、元の耐熱性を失っていないものが多数存在することを確認し、昨年までに得ていた結論である「触媒効率と耐熱性の間には取引関係がない」を確認した。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Toshiharu Suzuki et al.: "Sulfolobus tokodaii sp. nov.(f.Sulfolobus sp. strain 7), a new member of the Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan"Extremophiles. 6(1). 39-44 (2001)
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[Publications] Yutaka kawarabayasi et al.: "Complete Genome Sequence of an Aerobic Thermoacidophilic Crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain 7"DNA Research. 8(4). 123-140 (2001)
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[Publications] Raita Hirose et al.: "Crystal structures of mutants of Thermus thermophile IPMDH adapted to low temperatures"Protein Eng.,. 14(2). 81-84 (2001)
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[Publications] Toshiharu Suzuki et al.: "Adaptation of a thermophilic enzyme, 3-isopropylmalate dehydrogenase, to low temperatures"Protein Eng.,. 14(2). 85-91 (2001)
