ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター(PPAR)の機能およびその調節機構

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480193
• Research Institution: Himeji Institute of Technology
• Principal Investigator: 大隅 隆 姫路工業大学, 理学部, 教授 (50111787)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚本 利朗 姫路工業大学, 理学部, 助手 (30236864)
• Keywords: ペルオキシソーム / ペルオキシソーム増殖剤 / PPAR / PEX遺伝子 / コアクチベーター / Two-hybrid法 / ルシフェラーゼアッセイ / 核内レセプター

Research Abstract

PPARαに関し、以下の4つの課題について研究を行った。
(1)PEX11α遺伝子の転写調節:マウスPEX11α遺伝子のゲノム配列をクローニングした。得られたクローンは転写開始点上流2.5kbまでと、全エクソンおよびイントロンを含んでいた。上流部分をルシフェラーゼ遺伝子につないだレポーターベクターを構築し、HeLa細胞に導入したところ、同領域にプロモーター活性が存在することが示された。今後、このレポーターベクターを利用して、各アイソフォームおよびRXRを種々の組み合わせで強制発現させることにより、PPARによる転写調節活性を調べる。
(2)リガンドによるPPARα安定化:PPARαをHeLa細胞に強制発現させ、パルス-チェイス標識実験を行った。発現されたPPARαは速やかに分解されたが、リガンドであるWy14643により、顕著に安定化された。RXRを同時に発現させるとPPARαに対する明らかな安定化効果が見られ、これにリガンドを加えてもそれ以上には安定化されなかった。またラットヘパトーマH4IIEC3にWy14643を与えて培養するとペルオキシソーム酵素のアシル-CoAオキシダーゼは誘導されたが、このときPPARαの存在量は変化しなかった。以上の結果から、PPARαは細胞内でRXRとのヘテロダイマー形成によって安定化されるが、過剰なPPARαは速やかに分解され、リガンドはこの分解過程を抑制すると考えられた。
(3)AF-1領域と相互作用するコアクチベーター:PPARαのAF-1と相互作用するコアクチベーターの候補としてTAFII31、CBP、およびSRC-1を調べたが、動物細胞のTwo-hybrid法では、いずれも優位の相互作用を示さなかった。現在、酵母のTwo-hybrid法によるスクリーニングを試みている。
(4)PPARγ遺伝子の転写調節:マウスPPARγ2遺伝子の上流域を含むゲノムクローンをスクリーニングし、転写開始点上流7.8kbまでを含むクローンを得た。この領域をルシフェラーゼ遺伝子につないだレポーターベクターを作成し、脂肪細胞に分化した、または未分化の3T3-L1細胞にリポフェクションによって導入し、レポーターアッセイを行う条件を設定した。

Research Products

• [Publications] FUJIWARA,Chiharu: "Catalase-less peroxisomes. Implication in the milder forms of peroxisome biogenesis disorder"The Journal of Biological Chemistry. 275. 37271-37277 (2000)
• [Publications] YASUMO,Hiroaki: "Nuclear receptor binding factor-2(NRBF-2), a possible gene activator protein interacting with nuclear hormone receptors"Biochimica et Biophysica Acta. 1490. 189-197 (2000)
• [Publications] NICOLAS-FRANCES,Valerie.: "The peroxisome proliferator response element (PPRE) present at positions -681/-669 in the rat liver 3-ketoacyl-CoA thiolase B gene functionally interacts differently with PPARalpha and HNF-4"Biochemical and Biophysical Research Communications. 269. 347-351 (2000)
• [Publications] IMAMURA,Atsushi: "Restoration of biochemical function of the peroxisome in the temperature-sensitive mild forms of peroxisome biogenesis disorder in humans"Brain and Development. 22. 8-12 (2000)
• [Publications] IMAMURA,Atsushi: "Temperature-sensitive mutation of PEX6 in peroxisome biogenesis disorders in complementation group C (CG-C) : comparative study of PEX6 and PEX1"Pediatric Research. 48. 541-545 (2000)
• [Publications] OSUMI,Takashi: "Temperature sensitivity in peroxisome assembly processes characterizes miler forms of peroxisome biogenesis disorders"Cell Biochemistry and Biophysics. 32. 165-170 (2000)