GFPキメラ蛋白質によるMAPキナーゼの核シヤトル機構のダイナミックス

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480202
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 中西 守 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (90090472)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古野 忠秀 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (80254308) ; 平嶋 尚英 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (10192296)
• Keywords: 共焦点レーザ顕微鏡 / MAPキナーゼ / GFP / MAPキナーゼカスケード / 蛍光蛋白質 / キメラ蛋白質 / 核シヤトル / 好塩基球

Research Abstract

MAPキナーゼは細胞の分化・増殖の際に、中心的役割を果たす酵素である。抗原や細胞増殖因子などの刺激により活性化され、細胞外シグナルを核に伝達する。刺激応答の際にMAPキナーゼは核に移行すると推察されているものの、その核移行の分子機構についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、MAPキナーゼとMAPキナーゼカスケード蛋白質の細胞内動態のダイナミックを顕微光学法により追究した。具体的研究項目は次の3項目に分け推進した。(1)MAPキナーゼカスケード蛋白質と蛍光蛋白質GFP(またはCFP、YFP、RFP)とのキメラ遺伝子の調製と細胞内発現。(2)蛍光エネルギー移動法(FRET)の計測可能な顕微光学システムの確立。(3)MAPキナーゼの核シャトルとMAPキナーゼカスケード蛋白質のダイナミックスの追究を行った。初年度の平成12年度の研究では、まず、蛍光性蛋白質GFP誘導体とMAPキナーゼ(ERK2)およびMAPキナーゼ・キナーゼ(MEK)とのキメラ蛋白質遺伝子(プラスミド)を調製し、それをラット好塩基球白血病細胞株(RBL-2H3)に発現させた。そして、MAPキナーゼカスケードの各種キメラ蛋白質を安定に発現する好塩基球細胞株の樹立に成功した。そこで、調製した好塩基球細胞株と共焦点レーザ顕微鏡を活用し、好塩基球の抗原刺激に伴うMAPキナーゼの核シャトル機構のダイナミックスを追究した。その結果、抗原刺激に伴いMAPキナーゼ数分で核内に移行するが、その後、再び速やかに核外に放出されること解明した(約15分)。MAPキナーゼのこのような核シャトルにはMAPキナーゼ・キナーゼ(MEK)の働きが密接に関与していることも示した。実験結果の解析からは、MEK自身も細胞質内と核内をMAPキナーゼよりもはるかに速い速度でシャトルしていることが判明した。

Research Products

• [Publications] Dace, A.,Zhao,L.,Park,K.S.,Furuno,T.,Takamura,N.,Nakanishi,M.,West,B., et al.: "Hormone binding induces rapid proteasome-mediated degradation of thyroid hormone receptors."Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. 97. 8985-8990 (2000)
• [Publications] Ohshiro,H.,Suzuki,R.,Furuno,T.,Nakanishi,M.: "Atomic force microscopy to study direct neurite-mast cell (RBL) communication in vitro."Immunol.Lett.. 74. 211-214 (2000)
• [Publications] Suzuki,R.,Furuno,T.,Teshima,R.,Nakanishi,M.: "Bi-directional flow of in vitro mast cell-nerve communication observed by confocal laser scanning microscopy."Biol.Pharm.Bull.. 24. 291-294 (2001)
• [Publications] Furuno,T.,Hirashima,N.,Onizawa,S.,Sagiya,N.,Nakanishi,M.: "Nuclear shutting of mitogen-activated protein (MAP) kinase (extracellular signal-regulated kinase (ERK) 2) was dynamically controlled by MAP/ERK kinase after antigen stimulation in RBL-2H3 cells."J.Immunol.. (in press). (2001)
• [Publications] Amano,T.,Furuno,T.,Hirashima,N.,Ohyama,N.,Nakanishi,M.: "Dynamics of intracellular granules with CD63-GFP in rat basophilic leukemia cells."J.Biochem.. (in press). (2001)
• [Publications] Nakamura,R.,Nakanishi,M.: "Atomic force microscopy to study the effects of ITIM-bearing Fc γ RIIB on the activation of RBL-2H3 cells"Immunol.Lett.. 72. 167-170 (2000)