核蛋白質輸送担体importinβを利用した核膜孔複合体の分子構築の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480215
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 米田 悦啓 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80191667)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今本 尚子 大阪大学, 構造遺伝学研究センター, 助教授 (20202145)
• Keywords: 核膜孔複合体 / ヌクレオポリン / importin β / importin α / Ran / 核蛋白質輸送 / X線結晶構造

Research Abstract

核膜孔複合体の分子構築を解明するため、それ自身単独で通過可能な分子であるimportin βを指標にし、その点変異体を複数構築して、それぞれの核膜孔通過能を解析した。importin βのX線結晶構造解析のデータなどを参考にして、importin βの核膜孔通過に必須の領域に人工的に点変異を導入した変異型importin βを構築した。レコンビナント変異型importin βを培養細胞の細胞質あるいは核にインジェクションしたところ、Ranに結合する側のヘリックスに変異を導入した蛋白質(4B5Bと呼ぶ)は、野生型importin βに比較して、核への集積が顕著であった。一方、Ranとの結合には直接関係しない側のヘリックス構造に変異を導入した蛋白質(5A6Aと呼ぶ)は、野生型に比べて核への集積が低下していた。この結果は、セミインタクト細胞in vitro系においても再現が見られた。以上により、5A6Aは、核から細胞質への通過の能力は野生型と同程度に保たれているが、細胞質から核への移行活性は低下していることが推測され、4B5Bは、全く逆の活性変化を起こしていることが予測された。これらの変異蛋白質と核膜孔複合体構成因子(ヌクレオポリン)との親和性を計測することにより、蛋白質の核膜孔通過における方向性の鍵を握るヌクレオポリンが決定される可能性がある。また、これまで核蛋白質と輸送担体であるimportin βとをつなくアダプター分子として知られていたimportin αが、それ自身単独で核内に移行するという現象をはじめて見出した。このimportin α単独の核膜孔通過は、酵母からヒトまで種を越えて保存されていること、importin βの経路と競合しないことも明らかとなった。さらに、その挙動をin vitro系でリアルタイムで観察したところ、importin βの挙動とは全く異なり、個々の核ごとで蓄積する速度に大きな差があるという興味深い結果が得られた。このことから、これまで多様性はないと考えられていた核膜孔複合体の構造あるいは構成成分がそれぞれの核によって差異がある可能性が示唆されるとともに、蛋白質の核膜孔通過に大きく2つ以上の経路がある可能性が示された。

Research Products

• [Publications] Shimizu, S.: "Essential role of voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells"J. Cell Biol.. 152. 237-250 (2001)
• [Publications] Nagoshi, E.: "Dimerization of the sterol regulatory element-binding protein-2 via the helix-loop-helix-leucine zipper domain is prerequisite for its nuclear localization mediated by importin β"Mol. Cell. Biol.. 21. 2779-2789 (2001)
• [Publications] Jiang, C.-J.: "Molecular cloning of a novel importin α homologue from rice, by which constitutive photomorphogenic 1 (COP1) nuclear localization signal (NLS)-protein is preferentially nuclear imported"J. Biol. Chem.. 276. 9322-9329 (2001)
• [Publications] Akakura, S.: "A role for Hsc70 in regulating nucleo-cytoplasmic transport of a temperature-sensitive p53 (p53Val135)"J. Biol. Chem.. 276. 14649-14657 (2001)
• [Publications] Kurisaki, A.: "Transforming growth factor-b induces nuclear import of Smad3 in an importin-b1 and Ran-dependent manner"Mol. Biol. Cell. 12. 1079-1091 (2001)
• [Publications] Hieda, M.: "Nuclear import of the U1A splicesome protein is mediated by importin α/β and Ran in living mammalian cells"J. Biol. Chem.. 276. 16824-16832 (2001)
• [Publications] Takagi, M.: "A novel nucleolar protein, NIFK, interacts with the forkhead associated domain of Ki-67 antigen in mitosis"J. Biol. Chem.. 276. 25386-25391 (2001)
• [Publications] Haraguchi, T.: "BAF is required for emerin assembly into the reforming nuclear envelope"J. Cell Sci.. 114. 4575-4585 (2001)
• [Publications] Kobayashi, M.: "Nuclear localization of duplin, a β-catenin-binding protein, is essential for its inhibitory activity on the Wnt signaling pathway"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [Publications] Shibata, S.: "Nucleocytoplasmic transport of proteins and poly(A)+RNA at the reconstituted Tpr-less nuclei in living mammalian cells"Genes Cells. (in press). (2002)
• [Publications] Katahira, J.: "Complex formation between Tap and p15 affects binding to FG-repeat nucleoporins and nucleocytoplasmic shuttling"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)
• [Publications] Miyamoto, Y.: "Genomic organization and chromosomal localization of the importin al gene in the mouse"Gene. (in press). (2002)
• [Publications] Matsuoka, Yu.: "A chromodomain-containing nuclear protein, MRG15 is expressed as a novel type of dendritic mRNA in neurons"Neurosci. Res.. (in press). (2002)
• [Publications] Matsuoka, Yo.: "Bovine liver chromatin fraction contains actin polymerization activity inducing micronuclei formation when injected into prometaphase cultured cells"Cell Struct. Funct.. (in press). (2002)