2001 Fiscal Year Annual Research Report
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12480217
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| Research Institution | OKAYAMA UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
竹居 孝二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (40322226)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 浩司 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80325092)
絹田 正裕 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (40135942)
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| Keywords | エンドサイトーシス / リポソーム / 神経 / 脳 / イノシトールリン脂質 / PIP_2 / 無細胞系 / 小胞輸送 |
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| Research Abstract |
エンドサイトーシスの機構解明のために、昨年度われわれはリポソームを膜成分としてATPとGTP存在下に脳細胞質と反応させて小胞を形成させ、その小胞の大きさ、形成量を定量化するin vitro実験系を確立した。この実験系を用いて以下を明らかにした。
1.小胞形成のDynamin依存性
脳細胞質による小胞形成のDynamin 1依存性を調べる目的で,、脳細胞質から特異的抗体を用いてDynamin 1をdepleteしたものを上記実験系に用いたところ、小胞形成が80%阻害された。これにより、上記実験系の小胞形成がエンドサイトーシスによる小胞形成を再現していることを示した。
2.小胞形成に伴うイノシトールリン脂質の動態
昨年度われわれは小胞形成に伴って膜リン脂質phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP_2)がphosphatidylinositol-4-phosphate、さらにphosphatidylinositolに分解されることを見い出した。今年度は小胞形成に伴うPIP_2の合成の詳細について解析した。シナプスのクラスリン依存性エンドサイトーシスにおいて、クラスリンアダプタータンパクAP2はPIP_2に親和性を持ち、AP2の膜結合はGTFP結合型(活性型)ADP-ribosilation factor 6 (Arf6)により増加することから、Arf6がPIP_2合成を促進すると考えられた。そこで上記実験系においてPIP_2分解系をneomysinにより阻害し、Arf6によるPIP_2合成量の変化を調べた。GTP結合型Arf6存在下でのPIP_2量は、Arf6非存在下に比べ6.6倍、野生型Arf6存在下に比べ3.8倍に増加していた。この反応中には、PIP_2合成酵素PI-4-P5-kinaseの活性を上昇するPhosphatidic acidの生成はみられなかったことから、Arf6がPI-4-P5-kinaseを直接活性化する可能性が示唆された。
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[Publications] M.Kinuta: "Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate stimulates vesicle formation from liposomes by brain cytosol"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99. 2842-2847 (2002)
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[Publications] K.Farsad: "Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin-bilayer interactions"J.Cell Biol.. 155. 193-200 (2001)
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[Publications] Y.Nemoto: "Characterization of synaptojanin 2B isoforms expressed in brain and tests"J.Bilo.Chem.. 276. 41133-41142 (2001)
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[Publications] K.Takei: "Clathrin-mediated endocytosis : membrane factors pull the trigger"Trends in Cell Biol.. 11. 385-391 (2001)
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[Publications] H.Yamada: "Norepinephrine-evoked 5-Hydroxytryptamine secretion is Ca^<2+> dependent and mediated through exocytosis in rat pinealocytes"J.Neurochem. (印刷中). (2002)
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[Publications] M.Kinuta: "Determination of S-[2-carboxy-1-(1H-imidazol-4-y1) ethy1]glutathione, a novel metabolite of L-histidine, in tissue extracts from sunlight-irradiated rat by capillary electrophoresis"Electrophoresis. 22. 3365-3370 (2001)
