相同組み換え体細胞の核移植によるノックアウトブタ作出に関する基礎的研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480248
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森 匡 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (30230072)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 郁也 北海道大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90240275) ; 松本 健一 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (30202328) ; 高橋 芳幸 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (70167485) ; 鈴木 啓太 北海道大学, 農学部・附属農場, 助手 (60261335)
• Keywords: 核移植 / 遺伝子導入 / ブタ / ビエゾドライブマイクロマニュビレーター / イノシトール3リン酸 / カルシウムオシレーション / ゲノミックインプリンティング

Research Abstract

実験1 良質の核移植胚作成を目指して以下の実験を行った。
1-1)活性誘起物質の注入による卵子活性化方法の検討
核移植胚の発生にはより正常な卵子の活性化が必須である。そこで、活性化誘起物質として知られているイノシトール3リン酸(IP3)の卵子内注入による活性化を従来の電子刺激法と比較した。その結果、IP3による卵子活性化率は70-90%と高い値を示し、電気刺激法(75%)と変わらなかった。また、IP3注入による活性化については、用いる卵子の種類(性成熟前あるいは後の卵巣由来)について検討した。注入直後の細胞内Ca濃度上昇持続時間、注入卵子の分割胚率および得られた胚盤胞の細胞数は性成熟後の卵巣由来卵子が性成熟前の卵巣由来卵子より優れていた(それぞれ150秒対90秒、85%対70%、40個対20個)。
1-2)核移植胚作成方法の検討
ピエゾドライブマイクロマニュピレーターを用いて体細胞核移植胚を作成するための条件を検討した。その結果、卵子に傷害を与えることなくインジェクションを行える条件を定めた。今後、遠心による核レシピエント卵子細胞質の光透過性向上操作、移植体細胞の細胞膜破壊操作、卵子活性化時期について、核移植成功率、前核形成率、および胚盤胞への発生率を指標に最適化を図る必要がある。
実験2 遺伝子導入核移植胚における遺伝子発現制御を調べるため、ゲノミックインプリント遺伝子H19、IGF-2およびXistのブタホモログのクローニングを試みた。ヒトおよびマウス塩基配列を参考にPCRを行ったが相同性の高い配列はまだ得られず、今後ライブラリースクリーニングを行う予定である。