相同組み換え体細胞の核移植によるノックアウトブタ作出に関する基礎的研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480248
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森 匡 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (30230072)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 郁也 北海道大学, 先端科学技術共同研究センター, 助手 (90240275) ; 松本 健一 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (30202328) ; 高橋 芳幸 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (70167485) ; 鈴木 啓太 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 助手 (60261335)
• Keywords: 核移植 / 遺伝子導入 / ブタ / 遺伝子発現 / 核初期化 / ゲノミックインプリンティング

Research Abstract

遺伝子導入体細胞核移植胚の発生
ブタ胎児線維芽細胞にEGFP遺伝子ベクター(pCXN-EGFP,大阪大学遺伝情報実験施設 岡部博士より)をリポフェクションし、ネオマイシン選択によりEGFPを発現する細胞を作成した。これらの細胞の核移植によりトランスジェニック胚を作成し、蛍光顕微鏡で各発生ステージの胚の蛍光を検出・比較するとともに、一部の胚についてはRT-PCRに供してEGFP、OCT4およびIGF2、それぞれの遺伝子発現を調べた。EGFP蛍光は1細胞期胚から胚盤胞まで確認でき、また、EGFP遺伝子発現も確認された。胚発生に関与する遺伝子、OCT4とIGF2遺伝子の発現も受精胚の発現パターンと差は認められず、核移植によるトランスジェニック胚の正常初期発生が伺われた。今後は、レシピエントブタへの胚移植により妊娠初期の胚発生を確認する予定である。
移植された体細胞核の初期化
ピエゾドライブマイクロマニュピレータを用いて、体細胞核をレシピエント卵子に注入し、減数分裂時の核に特異的に発現が見られるsynaptonemal complex proteine (scp1)の局在を蛍光抗体染色法(抗体は京都大学再生医科学研究所 中馬博士より)により観察した。注入1時間後には体細胞核への局在は認められなかったが、2時間後には蛍光陽性が確認され、体細胞核注入後2時間で体細胞核が卵子核と同じ様な状態になる(核の初期化)と推察された。今後、この核の初期化が核移植胚の発生におよぼす影響を検討する必要がある。
ゲノミックインプリント遺伝子XistおよびH19のクローニング
ヒトとマウスで相同性が高い配列をもとにPCRを行ったが目的の遺伝子断片はクローニングできなかった。現在、ブタゲノミックラーブラリーのスクリーニング(によりこれら遺伝子をクローニングすべく実験中である。