相同組み換え体細胞の核移植によるノックアウトブタ作出に関する基礎的研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12480248
• Research Institution: HOKKAIDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 森 匡 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (30230072)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 郁也 北海道大学, 先端科学技術共同研究センター, 助手 (90240275) ; 松本 健一 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (30202328) ; 高橋 芳幸 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (70167485) ; 鈴木 啓太 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 助手 (60261335)
• Keywords: 核移植胚 / 遺伝子発現 / ジーンターゲッティング / Xist / ブタ

Research Abstract

I.核移植胚における遺伝子発現
体細胞および胚で発現する遺伝子についてRT-PCRにより調べた。Na/K-ATPaseおよびFGFについては体細胞・胚の両方で発現が確認された。エストラジオールレセプターについては体細胞で発現が認められたが、胚については確認できなかった。H19については体細胞・胚の両方とも発現を確認することはできなかった。
II.培養体細胞の相同組み換え効率
体細胞にターゲッティングベクターを導入したときの相同組み換え効率の指標を求めるため、マウスEC細胞株F9を用いてコネキシンXのターゲッティングを試みた。ベクターのトランスフェクションには不活性化HVJ (GenomeOne、石原産業)を用いた。90mmディッシュで培養した2×10^6の培養細胞に対してターゲッティングベクター(TNX4713)100μgをトランスフェクションした。トランスフェクション後600μg/mlのG418を含んだ選択培養液で一週間培養し、生存した細胞についてはベクターDNA配列とゲノム上のコネキシンX遺伝子配列に特異的なプライマーを用いたPCRを行った。選択培養後ディッシュ当たり約20個の細胞クローンが得られたが、相同組み換えを示すPCR結果は得られなかった。
III.ブタXist遺伝子のクローニング
最近データベースに登録されたブタXistのcDNA部分配列(AJ429140)をもとに5'および3'側のXist遺伝子のクローニングを試みた。T_<12>MNプライマー、ランダムプライマーあるいはブタXist特異的プライマーをRNA逆転写反応に用い、得られたcDNAを鋳型として各種の条件でPCRを行ったが、他の種と高い相同性を示す配列は得られなかった。

Research Products

• [Publications] Manabu Kawahara: "The suppression of fragmentation by stablization of actin filament in porcine enucleated oocytes"Theriogenology. 58. 1081-1095 (2002)
• [Publications] M.A.Martinez Diaz: "Effects of cycloheximide treatment and interval between fusion and activation on in vitro development of pig nuclear transfer embryos"Reprod Fertil Dev. 14. 191-197 (2002)
• [Publications] Koji Ikeda: "Effects of butyrolactonr I on the inhibition of meiotic resumption of porcine oocytes and subsequent development after somatic cell nuclear transfer"J Mamm Ova Res. 19. 46-51 (2002)
• [Publications] Tadashi Mori: "Estradiol production by porcine parthenogenetic embryos during early pregnancy"Theriogenology. 59. 371 (2003)