DNAを疑似固定したキャピラリーを用いる遺伝子の一塩基変異体診断法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12555237
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 前田 瑞夫 九州大学, 大学院・工学研究院, 教授 (10165657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 正治 九州大学, 大学院・工学研究院, 助手 (30304744)
• Keywords: DNA / 電気泳動 / 遺伝子診断 / 高分子 / 遺伝子 / 分離分析

Research Abstract

本研究では、キャピラリー内にアフィニティーリガンドとしてのDNA誘導体を修飾することにより、遺伝子の一塩基変異を迅速に検出するための遺伝子診断システムの基礎的知見の確立に成功した。開発したシステムは、キャピラリー内壁に一本鎖DNA担持ポリアクリルアミドを化学修飾したもの(壁面固定系)と、DNAをポリアクリルアミドに担持した高分子をキャピラリー内に充填したもの(疑似固定系)の2種類である。まず、これらのシステムにおいて、ガン原遺伝子rasの発ガン性一塩基変異を生じるコドン12を含む配列をアフィニティーリガンドとして、正常型配列と一塩基配列の分離検出を検討した。測定サンプルとしては、コドン12を含む12merを用い、アフィニティーリガンドとしては、コドン12を含む部位の相補鎖の6merあるいは12merを用いた。壁面固定、疑似固定とも、アフィニティーリガンドが6merの場合、正常型と変異型のピークとしての分離が可能であった。また、アフィニティーリガンドとして12merを用いた場合は、双方の系とも、変異型のみピークが検出され、正常型は検出されないと言う、検出ピークのオンオフによる判定が可能であった。すなわち、ピークによる分離か、検出ピークの有無による判定かは、測定配列とアフィニティーリガンドの配列の2本鎖形成における安定性(Tm)に依存することが明らかとなった。また、これらの検出においては、マグネシウムイオン濃度の調節が、分離検出に重要なファクターであることも見出した。さらに、より実際的な系として、壁面固定系に、実サンプルを意識してPCRにより増幅可能な60merのras配列を用いて分離を検討したところ、ピークの有無による正常型と一塩基変異体の判定に成功した。

Research Products

• [Publications] T.Katayama et.al.: "An affinity capillary electrophoresis for the separation of sequence isomers of oligonucleotide"Chem.Lett.. No.1. 106-107 (2000)
• [Publications] 前田瑞夫: "岩波講座「現代工学の基礎」第3巻前田瑞夫、「バイオ材料の基礎」"岩波書店. 158 (2000)