固相検出法による内分泌かく乱物質の迅速・高感度簡易計測法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12555238
• Research Institution: Ariake National College of Technology
• Principal Investigator: 正留 隆 有明工業高等専門学校, 物質工学科, 助教授 (30190341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田部井 久男 NTTアドバンステクノロジ株式会社, 先端基盤技術事業本部・デバイス技術部材料部門, 部門長 ; 今任 稔彦 九州大学, 大学院・工学研究院・化学システム工学専攻, 教授 (50117066) ; 浅野 泰一 八戸工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (80311108) ; 黒川 陽一 福岡県保健環境研究所, 管理部・環境計測課, 専門研究員
• Keywords: 内分泌かく乱物質 / シークエンシャルインジェクション / ビテロジェニン / 固相抽出 / 酵素免疫法 / 抗原抗体反応

Research Abstract

【緒言】近年、生物の内分泌系を撹乱する化学物質(内分泌撹乱物質)の生態系に及ぼす影響が社会問題になっている。これは内分泌撹乱物質がホルモン様作用を持つためである。例えば、女性ホルモンであるエストロジェンと類似作用をもつ内分泌撹乱物質が雄の魚類に摂取されると、元来雌の魚類にのみ存在するタンパク質であるビテロジェニン(Vg)が、雄の魚類に検出される。このことは雄の魚類中におけるVgの存在が内分泌撹乱物質による汚染の指標となることを意味している。従来、Vgの測定はマイクロプレートを用いる酵素免疫法により行われているが、操作が煩雑で時間を要する。本研究では、内分泌撹乱物質の指標であるVgの迅速な測定を行うことを目的として、抗体固定化マイクロビーズを用いるシークエンシャルインジェクション分析法を検討した。
【実験】まずプロテインAを用いてVgの1次抗体であるヒト免疫グロブリンGの固定化を行った。ビーズの懸濁液をセルに導入した後、測定対象のVg溶液をセルに導入した。次いで、ペルオキシダーゼにより酵素標識した抗Vg抗体を加え、Vgをサンドイッチ状に挟んだ複合体を形成させた。更に発色剤のο-フェニレンジアミン(OPD)溶液をセルに導入し、酵素反応生成物の吸光度を測定した。
【結果及び考察】Vg測定感度に及ぼす1次抗体とVgの反応及びその複合体と2次抗体の反応時間について検討し、それぞれの反応時間を2時間及び1時間と決定した。また、標識酵素とOPDとの反応条件を検討し、感度と測定時間を考慮して反応時間を20分とした。この条件で、5から120ppbの濃度範囲のVgと吸光度の間には良好な直線関係が成立した。OPDの酵素反応生成物の吸光度は酵素量に比例したので、この検量線より、Vgと酵素標識した二次抗体が1:1の結合関係にあることが分かった。本法の検出下限は5〜10ppbであり従来法のそれとほぼ同程度であった。

Research Products

• [Publications] T.Masadome: "Flow Injection Determination of Iodide Ion in a photographic developing solution Using Iodide Ion-Selective Electrode Detector"Talanta. 52. 1123-1130 (2000)
• [Publications] T.Masadome: "Relationship between the hydrophobicity of cations and the cationic response of a plasticized poly(vinyl chloride)membrane electrode with no added ion-exchanger"Analytical Sciences. 16. 383-389 (2000)
• [Publications] Y.Yano: "Application of a Microbial Sensor to the Quality Control of Meat Freshness"Talanta. (in press).