BACシステムを用いた簡便な組み換えヘルペスウイルス作成法の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12556049
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 川口 寧 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (60292984)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 健 山口大学, 農学部, 助教授 (90284273) ; 堀本 泰介 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (00222282) ; 見上 彪 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20091506) ; 田中 道子 国立感染症研究所, 感染病理部, 研究員 (10356248) ; 遠矢 幸伸 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (20180119)
• Keywords: ヘルペスウイルス / 組み替え法 / BACシステム

Research Abstract

本研究の目的は、本研究の目的はヘルペスウイルスの組み換え技術を"bacterial artificial chromosome (BAC) system"を用いて簡便な組み換え法を開発することによってヘルペスウイルスの新しいワクチン開発、遺伝子治療ベクターの開発、基礎研究を著しくスピードアップするこことにある。本年度に得られた結果は以下の通りである。
昨年度に作製に成功した単純ヘルペスウイルス(HSV)全ゲノムを有する大腸菌(YEbac102)の性状解析を行った。大腸菌よりHSVゲノムを抽出し培養細胞に導入したところ、感染性ウイルス(YK304)が産生された。また、YK304とCre recombinase発現アデノウイルスを共感染させることによって非常に高率にYK304 genomeよりbacmidが除去されたウイルス(YK311)が得られた。YK304およびYK311は培養細胞において野生株であるHSV-1(F)と同等な増殖能力を示した。さらに、マウス動物モデルを用いた解析によりYK304およびYK311がHSV-1(F)と同等の病原性を示すことが明らかになった。以上より、YEbac102は、完全長のHSV-1,genomeを保持し、野生株と同等な増殖能および病原性を保持する感染遺伝子クローンを有していることが明らかになった。
大腸菌の中で、実際に任意の変異をウイルスゲノムに導入する系を確立した。RecAを発現する大腸菌RR1にHSV全ゲノムを保持させた(YEbac103)。YEbac103内で、RecA法に従って、ICPO遺伝子に3つのアミノ酸置換を導入することに成功した。また、RecAを発現するトランスフアープラスミドを構築し、RR1を用いずに、RecA negativeの大腸菌YEbac102内で、ICP34.5部位に変異を導入することに成功した。
YEbac102、YEbac103と確立した組み換え系は、HSVの基礎研究、ワクチン開発、ベクター開発に多目的に有用であると考えられる。またこれらの系は他のヘルペスウイルスにも応用可能である。

Research Products

• [Publications] M.Tanaka et al.: "construction of an Excisable Bacterial Artificial Chromosome Containing a Full-Length Infections Clone of Herpes Simples Virus Type 1 : Viruses Reconstituted from the Clone Exhibits Wild-Type Properties In Vitro and In Vivo"Journal of Virology. 77. 1382-1391 (2003)
• [Publications] M.Tanaka et al.: "The Conserved region CR2 of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen Leader Protein Is a Multifunctional Domain that mediates Self-Association As well As Nuclear Localization and Nuclear Matrix Association"Journal of Virology. 76. 1025-1032 (2002)
• [Publications] Y.Kawaguchi et al.: "Conserved Protein Kinases Encode by Herpesviruses and a Cellular Protein Kinase Cdc2 Target the Same Phosphorylation Site In Eukaryotic Elongation Factor 18"Journal of Virology. 77. 2359-2368 (2003)
• [Publications] M.Igarashi et al.: "Physical interaction of Epstein-Barr Virus (EBV) nuclear antigen leader protein (EBNA-LP) with human estrogen-related receptor 1 (hERR1) : hERR1 interacts with a conserved domain of EBNA-LP that is critical for EBV-induced B-cell immortalization"Journal of General Virology. 84. 319-327 (2003)
• [Publications] G.Matsuda et al.: "Epstein-Barr virus (EBV) nuclear leader protein (EBNA-LP) forms complexes with a cellular anti-apoptosis protein bci-2 or its EBV counterpart BHRF1 through HS1-associated protein X-1"Microbiology and Immunology. 49. 91-99 (2003)
• [Publications] K.Kato et al.: "Characterization of the regulatory function of the Marek's disease virus serotype 1 ICP22 homologue"Veterinary Microbiology. 85. 305-313 (2002)