2002 Fiscal Year Annual Research Report
分裂酵母のオルガネラ輸送シグナルを用いた異種タンパク質生産システムの構築と実用化
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12556061
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
竹川 薫 香川大学, 農学部, 教授 (50197282)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浜 裕子 旭硝子, 中央研究所, 首席研究員
木村 義雄 香川大学, 農学部, 助教授 (10243750)
阪井 康能 京都大学, 農学研究科, 助教授 (60202082)
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| Keywords | 分裂酵母 / 異種タンパク質 / オルガネラ / 輸送シグナル |
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| Research Abstract |
竹川(代表者)らは、分裂酵母の異種タンパク質発現系を構築するために以下の成果を得た。(1)これまで使用されてきたウラシルやロイシンの分裂酵母栄養要求性マーカーの他に新たにリジン、アルギニン、アデニンなど複数の栄養要求性を保持した分裂酵母株を構築することができた。(2)分裂酵母のイオントランスポーターであるpmr1遺伝子を破壊した株を作成し、本破壊株が分裂酵母のN-結合型糖鎖のみならず、0-結合型糖鎖の付加にも欠損を示すことを明らかにした。また旭硝子の浜博士(分担者)との共同研究により、異種タンパク質をpmr1破壊株を用いて生産させたところ、実際に分泌生産が向上することが認められた。(3)分裂酵母の0-結合型糖鎖の付加に関与するマンノース転移酵素遺伝子を3つ同定した。これらの遺伝子破壊株が胞子形成欠損や温度感受性など様々な表現型を示すことを明らかにした。また実際に細胞表層の0-結合型糖鎖の組成が野生株と異なっていることを確認した。(4)分裂酵母の液胞局在ATPアーゼの欠損株を取得した。本破壊株は液胞の酸性化に欠損を示し、液胞タンパク質輸送やエンドサイトーシスなどの細胞内タンパク質輸送経路に欠損を示すことを明らかにした。(5)分裂酵母の全ゲノムから出芽酵母の液胞タンパク質輸送に関与するVPS遺伝子と相同性の高い遺伝子を同定して、これらの遺伝子破壊株を50以上作成した。またこれらの破壊株で液胞タンパク質が細胞表層へとミスソートしていることを確認した。阪井(分担者)らはCandida属酵母の主要なプロテアーゼであるプロテアーゼAとBを破壊した株を構築し、これらの株で異種タンパク質を生産した場合にはタンパク質の分解を抑えて生産性の向上が認められることを明らかにした。また高等動物のプロテアーゼであるカテプシンCを生産させてその細胞内局在などを明らかにした。
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[Publications] Kaoru Takegawa他: "Expression and characterization of Schizosaccharomyces pombe vacuolar carboxypeptidase Y in Saccharomyces cerevisiae"Curr. Genet.. 42. 252-259 (2003)
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[Publications] Masayuki Onishi他: "Role of phosphatidylinositol 3-phosphate in formation of forespore membrane in Schizosaccharomyces pombe"Yeast. 20. 193-206 (2003)
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[Publications] Hong Cheng他: "Role of the Rab GTP-Binding Protein Ypt3 in the Fission Yeast Exocytic Pathway, and Its Connection to Calcineurin Function"Mol. Biol. Cell. 13. 2963-2976 (2002)
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[Publications] Toshihiro Komeda他: "Production of active bovine cathepsin C (dipeptidyl aminopeptidase I) in the methylotrophic yeast Candida boidinii"Appl. Microbiol. Biotechnol.. 59. 252-258 (2002)
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[Publications] Toshihiro Komeda他: "Construction of protease-deficient Candida boidinii strains useful for recombinant protein production : Cloning and disruption of proteinase A gene (PEP4) and proteinase B gene (PRB1)"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66. 628-631 (2002)
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[Publications] Bumjun Lee他: "Physiological role of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in the methylotrophic yeast Candida boidinii"Microbiology. 148. 2697-2704 (2002)
