2001 Fiscal Year Annual Research Report

光学的手法FRETの適用による膜機能分子の構造変化と分子間相互作用の研究の新展開

Research Project

Project/Area Number	12557004
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	久保義弘東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80211887)
Keywords	代謝型 / グルタミン酸 / 受容体 / FRET / GFP / 構造変化
Research Abstract	分子内構造の変化を光学的に解析するためには、目的とする場所に特異的に蛍光ラベルを導入することが鍵となる。昨年度は、点変異により導入したCys残基を利用する方法により化学ラベルを試みた。バックグラウンドを減少させる種々の努力を試み、進展を遂げたが、現時点で(Fluorescent Energy Transfer (FRET)の検出までは至っていない。今年度は、もうひとつのアプローチである、GFP融合蛋白の作成による蛍光ラベルを試みる以下の実験を行った。「代謝型グルタミン酸受容体(mGLuR)のサブユニット間相互作用の検出」構造解析の結果から、mGluRは、ホモ2量体で構成され、リガンドの結合により構造変化がおこること、リガンドの非存在化でもその揺らぎがあり、basal activityを引きおこしていることが推定されている。このdynamicな構造変化を生理学的に捉えるために、mGluRの細胞内領域に2色の蛍光蛋白CFPもしくはYFPを融合させた分子を作成した。現在、2分子を共発現させることにより、FRETがおきるかどうかを、蛍光分光光度計による測定蛍光波長スキャン、acceptor bleaching法などにより解析中である。Preliminaryな実験結果として、リガンド非存在下で若干のFRETを検出している。今後、さらに、FRET効率が、リガンドの投与やクラスター化分子Homer 1cの共存により変化するかどうかについて解析を進める。また、コンストラクトについても、CFPやYFPの位置を変える、適当なリンカーを導入するなどの手法により、FRETをより効率よく記録できるよう改良する計画である。

Research Products
(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Kubo Y, Murata Y.: "Control of rectification and permeation by two distinct sites after the second transmembrane region in Kir2.1 K^+ channel"J Physiol. 531. 645-660 (2001)
[Publications] Saitoh O, Masuho I, Terakawa I, Nemoto S, Asano T, Kubo Y.: "RGS8 requires its N-terminus for subcellular localization and acute desensitization of G protein gated K^+ channels"J Biol Chem. 276. 5052-5058 (2001)
[Publications] Murata Y, Okado H, Kubo Y.: "Characterization of heteromultimeric G-protein coupled inwardly rectifying potassium channels of the tunicate tadpole with a unique property"J Biol Chem. 276. 18529-18539 (2001)
[Publications] Murata Y, Okado H, Katsuyama Y, Okamura Y, Kubo Y: "Primary Structure, developmental expression and functional properties of an inward rectifier K^+ channel of tunicate"Receptors and Channels. 7. 387-399 (2001)
[Publications] Soom M, Schonherr R, Kubo Y, Kirsch C, Klinger R, Heinemann SH.: "Multiple P1P2 binding sites in Kir2.1 inwardly rectifying potassium channels"FEBS lett. 490. 49-53 (2001)
[Publications] Misaka T, Miyashita T, Kubo Y.: "Primary structure of a dynamin-related mouse mitochondrial GTPase and its distribution in brain, subcellular localization and effect on mitochondrial morphology"J Biol Chem. (in press).

2001 Fiscal Year Annual Research Report

光学的手法FRETの適用による膜機能分子の構造変化と分子間相互作用の研究の新展開

Principal Investigator

久保 義弘 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80211887)

Research Products

[Publications] Kubo Y, Murata Y.: "Control of rectification and permeation by two distinct sites after the second transmembrane region in Kir2.1 K^+ channel"J Physiol. 531. 645-660 (2001)

[Publications] Saitoh O, Masuho I, Terakawa I, Nemoto S, Asano T, Kubo Y.: "RGS8 requires its N-terminus for subcellular localization and acute desensitization of G protein gated K^+ channels"J Biol Chem. 276. 5052-5058 (2001)

[Publications] Murata Y, Okado H, Kubo Y.: "Characterization of heteromultimeric G-protein coupled inwardly rectifying potassium channels of the tunicate tadpole with a unique property"J Biol Chem. 276. 18529-18539 (2001)

[Publications] Murata Y, Okado H, Katsuyama Y, Okamura Y, Kubo Y: "Primary Structure, developmental expression and functional properties of an inward rectifier K^+ channel of tunicate"Receptors and Channels. 7. 387-399 (2001)

[Publications] Soom M, Schonherr R, Kubo Y, Kirsch C, Klinger R, Heinemann SH.: "Multiple P1P2 binding sites in Kir2.1 inwardly rectifying potassium channels"FEBS lett. 490. 49-53 (2001)

[Publications] Misaka T, Miyashita T, Kubo Y.: "Primary structure of a dynamin-related mouse mitochondrial GTPase and its distribution in brain, subcellular localization and effect on mitochondrial morphology"J Biol Chem. (in press).

久保義弘東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80211887)