光学的手法FRETの適用による膜機能分子の構造変化と分子間相互作用の研究の新展開

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12557004
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University graduate School
• Principal Investigator: 久保 義弘 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80211887)
• Keywords: 代謝型 / グルタミン酸 / 受容体 / FRET / GFP / 構造変化

Research Abstract

分子内構造の変化を光学的に解析するためには、目的とする場所に特異的に蛍光ラベルを導入することが鍵となる。昨年度より、GFP融合蛋白の作成による蛍光ラベルを試みる以下の実験を進めている。構造解析の結果から、代謝型グルタミン酸受容体(mGluRl)は、ホモ2量体で構成され、リガンドの結合よリ構造変化がおこること、リガンドの非存在化でもその揺らぎがありbasal activityを引きおこしていることが推定されている。このdynamicな構造変化を生理学的に捉えるために、まず、mGIuR1のC端細胞内領域の末端に2色の蛍光蛋白CFPもしくはYFPを融合させた分子をまず作成した。そして、HEK293細胞に2分子を共発現させることによりFRETがおきるかどうかを、蛍光分光光度計による測定蛍光波長スキャン、acccptor b1eaching法などにより解析した。その結果リガンド非存在下で若干のFRETを検出した。しかし、その強度が微弱だったため、mGluR1の様々螂位にCFPもしくはYFPを融合させた分子を系統的に作成した。その中で、第7膜貫通部位の直下、第1と第2の膜貫通部位間の細胞内チェーンに融合させたコンストラクトにおいて、明確なFRETを検出した。さらに、リガンド投与によるFRET効率の変化(分子構造変化)の解析を目的として、膜表面の分子由来の蛍光に限定して測光するために全反射顕微鏡下におけるFRET解析を試み既に成功している。今後、膜上のmGluR1の各種リガンド投与による構造変化の解析を行う。

Research Products

• [Publications] Misaka, T., Miyashita, T., Kubo, Y: "Primary structure of a dynamin-related mouse mitochondrial GTPase and its distribution in brain subcellular localization effect on mitochondrial morphology"Journal of Biological Chemistry. 277. 15834-15842 (2002)
• [Publications] Ai, T.Fujiwara, Tsuji, K., Otani, H., Nakano, S., Kubo, Y., Hori, M.: "Novel KCNJ2 mutation in familial periodic paralysis with ventricular dysrhymia"Circulation. 105. 2592-2594 (2002)
• [Publications] Saitoh, O., Murata, Y., Odagiri, M., Itoh, H., Misaka, T., Kubo, T.: "Alternative splicing of RGS8 gene determines inhibitory function of receptor-type-specific Gg signaling"Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99. 10138-10143 (2002)
• [Publications] Murata, Y., Fujiwara, Y., Kubo, Y.: "Identification of a site involved in the block by extracellular Mg^<2+> and Ba^<2+> as well as permeation of K^+ in Kir2.1 K^+ channel"Journal of Physiology. 544. 665-677 (2002)
• [Publications] Fujiwara, Y., Kubo, Y.: "Ser 165 in the second transmembrane region of the Kir2.1 channel determines its susceptibility to blockade by intracellular Mg^<2+>"Journal of General Physiology. 120. 677-692 (2002)
• [Publications] Abe, H., Misawa, T., Tateyama, M., Kubo, Y.: "Effects of co-expression with Homer isoforms on the function of metabotropic glutamate receptor12"Molecular and Cellular Neuroscience. (in press). (2003)