多色発光レポータによる複数遺伝子発現モニタリングとマルチチャネル計測

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12557005
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近江谷 克裕 静岡大学, 教育学部, 助教授 (20223951) ; 白川 哲夫 北海道大学, 歯学部・付属病院, 講師 (00187527) ; 安倍 博 北海道大学, 大学院・医学研究科, 講師 (80201896) ; 久保田 英博 アトー株式会社, 技術開発部・学術研究課, 課長(研究職)
• Keywords: マルチレポータシステム / ルシフェラーゼ / 遺伝子導入 / 時計遺伝子 / 転写因子 / 生物発光

Research Abstract

本年度は、複数の生物発光レポータ遺伝子の導入ベクターの構築、多色発光遺伝子の安定発現株の作成、これを用いた分別測光システムの構築を目的として研究を行った。また、測光システムが完成した際に実験に用いるためのプロモータ解析とベクター構築を行った。
(1)多色レポータ導入株化細胞の確立と、多色発光の同時記録システムの開発:赤色と緑色領域の発色波長をもつ鉄道虫ルシフェラーゼのcDNAを同一ベクターに組み込み、異なるプロモータにより発現を調節した。これをNIH3T3細胞に導入し、安定発現株を得た。また、大腸菌に赤色あるいは緑色発光波長をもつ鉄道虫ルシフェラーゼの強制発現ベクターを導入し、赤色と緑色発光コロニーを得た。
(2)測定系の開発:冷却CCDカメラとルミノキャプチャーを暗箱にセットし、液晶フィルターを介して各波長の10分間の発光を測定した。その結果、赤色変異体は630nmにピークをもつを確認した。この変異体の発光は530nm付近にピークをもつホタルルシフェラーゼの発光の分別測光も可能であることを確認した。緑色変異体には発光ピークの得られるコロニーがなかったため、再度検討中である。
(3)遺伝子発現の連続測定系の構築:時計遺伝子Per1のプロモータ領域1.9kbの下流にホタルルシフェラーゼを組み込んだベクターを構築し、CLOCK,BMAL1遺伝子による促進とPER2による抑制の時間経過を検討した。その結果、導入12時間後より転写因子蛋白による発光促進効果がみられ、また抑制系のPer2発現ベクターのCo-transfectionでは、6時間後から発光の抑制が明らかとなった。これによりNIH3T3細胞に導入した遺伝子が、生物時計内での転写促進や抑制とほぼ同じ時間経過で機能を発揮することが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Shirakawa, T.: "Synchronization of circadian firing rhythms in cultured rat suprachiasmatic neurons."Eur.J.Neurosci.. 12. 2833-2838 (2000)
• [Publications] Shinohara, K.: "Circadian release of excitatory amino acids in the suprachiasmatic nucleus culture is Ca^<2+>-independent."Neurosci.Res. 36. 245-250 (2000)
• [Publications] Ikeda, M.: "cDNA cloning of a novel bHLH-PAS transcription factor superfamily gene, BMAL2 : Its mRNA expression, subcellular distribution, and chromosomal localization."Biochem.Biophys.Res.Commun. 275. 493-502 (2000)
• [Publications] Masubuchi, S.: "Clock genes outside the suprachiasmatic nucleus involved in manifestation of locomotor activity rhythm in rats."Eur.J.Neuro-science.. 12. 4206-4214 (2000)
• [Publications] Honma, S.: "Synaptic communication of cellular oscillations in the rat suprachiasmatic neurons."Neurosci.Lett.. 294. 113-116 (2000)
• [Publications] Tanahashi, Y.: "Continuous measurement of targeted promoter activity by a secreted bioluminescence reporter, Vargula hilgendorfii luciferase"Analytica Biochem.. 289(in press). (2001)
• [Publications] Namihira, M.: "Circadian pattern, light responsiveness and localization of rPer1 and rPer2 gene expression in the rat retina."Neuroreport. 12(in press). (2001)
• [Publications] Abe, H.: "Clock gene expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice."Mol.Brain Res.. (in press). (2001)
• [Publications] Namihira, M.: "Daily variation and light responsiveness of mammalian clock gene Clock and its partner gene, BMAL1, transcripts in the pineal body and different areas of brain in rats."Neuroreport. (in press). (2001)
• [Publications] Suzuki, T.: "Quantitative trait locus analysis of abnormal circadian period in CS mice."Mammalian Genome. (in press). (2001)
• [Publications] 本間研一: "時計遺伝子"脳の科学. 22. 499-503 (2000)
• [Publications] 本間さと: "時間医学ヒトのリズムー環境への同調メカニズム"脳の科学. 22. 555-561 (2000)
• [Publications] 安倍博: "体内時計の分子機構"自律神経. 37. 163-168 (2000)
• [Publications] 本間さと: "時計遺伝子と脳のリズム"神経研究の進歩. 44. 868-873 (2000)
• [Publications] Honma, S.: "Zeigebers, Entrainment and Masking of the Circadian System"Hokkaido Univ.Press, Sapporo,. (2000)