多色発光レポータによる複数遺伝子発現モニタリングとマルチチャネル計測

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12557005
• Research Institution: HOKKAIDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近江谷 克裕 独立行政法人, 産業技術総合研究所, 主任研究員 (20223951) ; 白川 哲夫 北海道大学, 大学院・歯学研究科・附属病院, 講師 (00187527) ; 安倍 博 北海道大学, 大学院・医学研究科, 講師 (80201896) ; 久保田 英博 アトー株式会社, 技術開発部・学術研究課, 課長(研究職)
• Keywords: 生物発光 / マルチレポータシステム / 遺伝子導入 / ルシフェラーゼ / 転写因子

Research Abstract

本研究は、複数の生物発光レポータ遺伝子を細胞に導入し遺伝子発現を分別測光することにより、複数遺伝子発現の多点解析を行い、細胞内遺伝子相互機能解析を可能とすることにある。本年度は以下の3実験を行った。
(1)2色の鉄道虫ルシフェラーゼの同時発現ベクター安定発現株における分別測光:赤および緑の波長領域にピークをもつ2種の鉄道虫ルシフェラーゼは、同一基質で発光する酵素である。そこでバゾプレッシンプロモータ下流に赤色ルシフェラーゼcDNA、CMVプロモータ下流に緑色ルシフェラーゼcDNAをpcDNA3に同時に組み込んだベクターを構築し、vasopressin産生腫瘍細胞株であるLu165細胞株に導入し発光測定を行った。その結果、vasopressin遺伝子発現を発光により検出することが出来た。
(2)ホタルとウミボタルルシフェラーゼの安定発現株細胞における分別測光:強力な発光が得られるホタルとウミボタルルシフェラーゼの同時安定発現株を構築し、両者の分別測光を行った。GH3は成長ホルモン産生細胞株である。そこで、成長ホルモンプロモータ支配下にウミボタルルシフェラーゼを発現する安定導入株細胞にホタルルシフェラーゼを強制発現させ、両酵素の基質を同時に培養液に投与して発光を測定した。その結果、両者は生細胞で分別測光可能であり、リアルタイムで2遺伝子発現の同時モニタリングが可能となった。
(3)複数時計遺伝子発現の連続測定系の構築:複数の時計遺伝子の転写・翻訳フィードバックループによりリズムを発振している生物時計機構は、各遺伝子発現が特定のリズムパターンで発現するため、分別発光レポータの応用により格段の発展が期待できる。そこで、時計遺伝子BMAl1の上流配列を解析し、機能ドメインを明らかにした。このプロモータ配列の下流にGFPおよびルシフェラーゼcDNAを組み込んだトランスジェニックマウスを現在制作中である。

Research Products

• [Publications] Tanahashi, Y.: "Continuous measurement of targeted promoter activity by a secreted bioluminescence reporter, Vargula hilgendorfii luciferase"Analytica Biochemistry. 289. 260-266 (2001)
• [Publications] Namihira, M.: "Circadian pattern, light responsiveness and localization of rPer1 and rPer2 gene expression in the rat retina"Neuroreport. 12. 471-475 (2001)
• [Publications] Abe, H.: "Clock gene expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice"Mol. Brain Res. 87. 92-99 (2001)
• [Publications] Suzuki, T.: "Quantitative trait locus analysis of abnormal circadian period in CS mice"Mammalian Genome. 12. 272-277 (2001)
• [Publications] Tsunoda, M.: "Effects of light and sleep stages on heart rate variability in humans"Psych.Clin.Neurosci.. 55. 285-286 (2001)
• [Publications] Shirakawa T.: "Multiple oscillators in the suprachiasmatic nucleus"Chronobiol. Int.. 18. 371-387 (2001)
• [Publications] Miyazaki, T.: "Phase-advance shifts of human circadian pacemaker are accelerated by daytime physical exercise"Am. J. Physiology. 281. R197-R205 (2001)
• [Publications] Nakamura, W.: "Regional pacemakers composed of multiple oscillator neurons in the rat suprachiasmatic nucleus"Eur. J. Neurosci.. 14. 666-674 (2001)
• [Publications] Yoshihara, T.: "Liquid mean attenuates meal anticipation in rat adrenocortical activity"Physiol. Behav.. 74. 133-137 (2001)
• [Publications] Masubuchi, S.: "Circadian activity rhythm in Clock mutant mouse by methamphetamine"Eur. J. Neurosci.. 14. 1177-1180 (2001)
• [Publications] Abe, H.: "Behavioral rhythm splitting in the SC mouse is related to clock gene expressions outside the suprachiasmatic nucleus"Eur. J. Neurosci.. 14. 1121-1128 (2001)
• [Publications] 本間さと: "哺乳動物生物時計の多振動体モデル"神経研究の進歩. 45. 775-782 (2001)
• [Publications] 本間さと: "視交叉上核と生物時計"Clinical Neuroscience. 19. 1132-1134 (2001)
• [Publications] 本間さと: "時計遺伝子発現と行動リズム"分子精神医学. 11. 449-454 (2001)