線虫を用いた残留ダイオキシン類の低減化システムの確立

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12557033
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 蔵崎 正明 北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 助手 (80161727)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 細川 敏幸 北海道大学, 高等教育機能開発総合センター, 助教授 (00157025) ; 伊藤 敬三 (株)フロンティア・サイエンス, 技術研究所, 所長 (40213037) ; 齋藤 健 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (40153811)
• Keywords: ダイオキシン / 測定系の構築 / 分解系の構築 / 環境ホルモン / CYP1A1転写制御領域 / 培養細胞

Research Abstract

近年、内分泌撹乱化学物質の一種であるダイオキシン類による環境汚染は、ヒトの発癌性の増加および催奇形成の原因と考えられており、さらに世代を超えた影響をもたらす恐れがあることから、深刻な社会問題になりつつある。本研究においては、環境中に汚染されたダイオキシンの低減、特にその修復が難しといわれている土壌中ダイオキシンの分解を遺伝子組換え体を利用して行うシステムを確立することを目的とした。昨年度はダイオキシン分解の可能性のある酵素6種の遺伝子を枯草菌および白色腐朽菌からクローニングし全塩基配列を決定した。また、レポーターアッセイ系確立のためにCYP1A1遺伝子のプロモーター領域をPCR法にて得、GFP遺伝子と結合させてダイオキシン様物質に応答することを確認した。本年度はこれらの成果の上にダイオキシン分解酵素の発現系を構築し、ダイオキシン測定系の確立を目指すためにレポーターアッセイ系の実用化を目指す。
当該年度において
ダイオキシン分解酵素発現系の構築
昨年度クローニングした白色腐朽菌由来、および枯草菌由来のダイオキシン分解酵素遺伝子全長クローン6種をそれぞれ大腸菌発現ベクターに組込みそれぞれの酵素を得、ダイオキシン分解能を調べた。その結果枯草菌由来の過酸化酵素の1種にダイオキシン分解能が認められた。この遺伝子の培養細胞系での発現系を構築し、レポーターアッセイ系との共導入を試みた。その結果モニタリングしながら低減化させるという当初目的が可能であるとの結論を得た。
レポーターアッセイ系の確立
昨年度構築したダイオキシン応答性レポーター細胞株の検出感度の向上を目指しfmolオーダーでの検量線の直線性が確かめられ、その再現性も良好であることから実用化レベルにあることが確かめられた。環境サンプルでの測定も試み良好な結果を得た。

Research Products

• [Publications] T.Numata et al.: "Bcl-2-liuked apoptosis due to increase in NO synthase in brain of SAMP 10"Biochemical and Biophysical Research Communications. 297(3). 517-522 (2002)
• [Publications] S.Sato et al.: "Protective effect of taurine against renal interstitial fibrosis of rats induced by cisplatin"Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 365. 277-283 (2002)
• [Publications] S.Saito et al.: "Localization of the induced metallothionein and DNA damage in rat kidney after gold injection"Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50. 1263-1271 (2002)
• [Publications] M.Kurasaki et al.: "A developed method of terminal deoxynucleotidyl transferase system for quantification of DNA damage caused by apoptosis"Analytical Sciences. 17supplement. i1547-i1550 (2001)