2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12557192
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
村山 洋二 岡山大学, 歯学部, 教授 (50029972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西村 英紀 岡山大学, 歯学部・付属病院, 講師 (80208222)
新井 英雄 岡山大学, 歯学部・付属病院, 講師 (70222718)
高柴 正悟 岡山大学, 歯学部, 助教授 (50226768)
原田 慶宏 ライオン株式会社, 研究開発本部・生物科学センター, 副主任研究員
苔口 進 岡山大学, 歯学部, 助教授 (10144776)
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| Keywords | 歯周病細胞 / リアルタイムPCR / 16S rRNA / 細菌検査 |
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| Research Abstract |
1.液相ハイブリダイゼーションの検討
16S rRNA遺伝子の保存領域からプライマーを設計し、すべての菌種の16S rRNA遺伝子を増幅可能とした。このPCR産物にacridinium ester標識した菌種特異的プローブをハイブリダイズさせ、歯周病細菌の検出を試みた。標識したacridinium esterはプローブがハイブリダイズ反応で2本鎖DNAを形成することでその後の加水分解操作から保護され、シグナル光を発生させる。この加水分解からの保護は、標識がプローブの中央に位置した場合には高い確率で行われることが報告されている。しかしながら、オリゴプローブ中央へのacridinium ester標識はパテントの理由で日本国内での発注が不可能であった。そこで、標識をプローブの末端に行い、検出を試みた。結果、加水分解やハイブリダイズ反応の条件を様々変更してみたが、検出感度、特異性ともに満足のいく結果を得られなかった。
2.リアルタイムPCR法の検討
液相ハイブリダイゼーションによる検出系は、プローブの標識法の問題点から歯周病細菌の検査システムに応用することが困難であった。そこで、リアルタイムPCR法を応用した検査システムを開発することとした。PCR反応のモニタリングにはパーキンエルマー社のGeneAmp5700を用いた。P.gingivalis,P.intermedia,A.actinomycetemcomitans,P.nigrescenceの各菌種について特異プライマーを設計し、特異性、感度、定量性について検討した。各菌種のプライマーはそれぞれがターゲットとする菌種とのみ特異的に反応し、感度は従来のPCR法と同じく10^2レベルであった。リアルタイムPCR法は特に定量性に優れた方法であり、10^2-10^7の範囲での定量が可能であった。
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[Publications] Iwamoto Y,Murayama Y et al.: "The effect of anti-microbial periodontal treatment on circulating TNF-a and glycated hemoglobin level in patients with type 2 diabetes"Jornal of Periodontology. (in press). (2001)
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[Publications] Sawada S,Murayama Y et al.: "Development of 16S rDNA-based PCR assay for detecting Centipeda periodontii and Selenomonas sputigena"Letters in Applied Microbiology. 30(6). 423-426 (2000)
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[Publications] Sawada S,Murayama Y et al.: "Periodontal conditions of patients with severe compromised hosts"84^<th> American Academy of periodontology. (Abstract).
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[Publications] 鷹谷博一,村山洋二 ら: "重度易感染性宿主患者の歯周感染の実態"岡山歯学会. 総会号. 7-7 (2000)
