2000 Fiscal Year Annual Research Report
相同組換えによる高等真核細胞への遺伝子導入の超高率化
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12557208
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
榎本 武美 東北大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (80107383)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古市 泰宏 東北大学, エイジーン研究所, 所長(研究職)
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| Keywords | RecQファミリーヘリカーゼ / ブルーム症候群 / BLM / 酵母Sgs1 / targeted-integration / 阻害剤スクリーニング / 相同組換え |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、高等真核細胞のtargeted integrationの効率を高度に上昇させる方法論の開発である。我々は、ヒトの遺伝病であるブルーム症候群の原因遺伝子産物(BLM)の機能が欠損すると、targeted integrationの効率が極端に上昇することを観察した。そこで本研究では、BLMにより抑制されていた相同組換えがどのようなタンパク質によって担われているのかをBLM欠損細胞を用いて解析することにより明らかにするとともに、BLMタンパク質の阻害剤を開発することにより、BLMの機能を抑えることにより種々の高等真核細胞で効率よくtargeted integrationを起こす方法を確立する。
1.BLM^<-/->DT40細胞を出発材料にして、DNA組換えに関係する遺伝子、RAD51、RAD54、MRE11の破壊細胞を作製した。また、BLMとATM遺伝子の二重破壊株を作製して解析することにより、BLM遺伝子破壊株で上昇するtargeted integrationにATMが関与することが明らかになった。
2.酵母のSGS1遺伝子(BLMの酵母相同遺伝子)破壊株に、ガラクトースで発現が誘導されるSGS1遺伝子をもつ多コピープラスミドを導入して、ガラクトース添加により酵母が死ぬ系を確立した。
3.2の系ではSgs1の過剰発現と増殖の停止が相関していた。また、DNAヘリカーゼ活性のないSgs1を過剰発現させても増殖の阻害が観察されなかったことから、増殖阻害にDNAヘリカーゼ活性が関係していることが明らかになった。
4.2の系を用いて、ペプチドライブラリープラスミドをスクリーニングし、Sgs1の活性を阻害する可能性のある3つのクローンを単離した。
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[Publications] Fumitoshi Onoda: "Elevation of sister chromatid exchange in Saccharomyces cerevisiae sgs1 disruptants and the relevance of the disruptants as a system to evaluate mutations in Bloom's syndrome gene."Mutation Research. 459. 203-209 (2000)
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[Publications] Wensheng Wang: "Possible association of BLM in decreasing DNA double strand breaks during DNA replication."EMBO Journal. 19. 3428-3435 (2000)
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[Publications] Atsuko Miyajima: "Sgs1 helicase activity is required for mitotic but apparently not for meiotic functions."Molecular and Cellular Biology. 20. 6399-6409 (2000)
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[Publications] Atsuko Miyajima: "Different domains of Sgs1 are required for mitotic and meiotic functions."Genes and Genetic Systems. 75. 319-326 (2000)
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[Publications] Fumitoshi Onoda: "Involvement of SGS1 in DNA Damage-Induced Heteroallelic Recombination that Requires RAD52."Molecular General Genetics. 264. 702-708 (2001)
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[Publications] Ayako Ui: "Possible involvement of Top3 via the N-terminal region of Sgs1 in the complementation of MMS sensitivity and the suppression of hyper recombination."Molecular General Genetics. (in press).
