2001 Fiscal Year Annual Research Report
集団分子診断を目指した蛍光相関遺伝子検出システムの開発
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12557235
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
金城 政孝 北海道大学, 電子科学研究所, 助教授 (70177971)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石館 文善 カールツァイス株式会社, 顕微鏡部・システム研究グループ, グループ長
野村 保友 山形大学, 工学部, 助教授 (80237883)
西村 吾朗 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (30218193)
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| Keywords | FA-PCR / PCR / 蛍光測定 / 蛍光相関分光法 / 遺伝子発現 / 単一分子検出 / SNP |
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| Research Abstract |
特定遺伝子やその発現の検出には、様々な手法の中でもPCR(Polymerase Chain Reaction)やRT-PCR法が知られているが、申請者等は極微小領域を出入りする蛍光分子の動きに由来する蛍光揺らぎを測定することで、その簡便な検出法の開発を行った。
一本鎖短鎖DNA(プライマー)から二本鎖長鎖(ターゲットDNA)へ分子量(すなわち長さ)と構造がともに変化し、そのため並進拡散定数(ブラウン運動の速さ)が大きく変化する。その速度変化を蛍光相関分光法を用いて簡便に、しかも単一分子レベルの高感度で測定することで標的遺伝子の増幅過程を反応溶液中にて定量することを目的とした。
PCRを行う時に、片方のプレイマーに蛍光標識を行うだけでは、反応終了後に大多数のフリーな未反応蛍光標識プライマーが残像する。それを避けるために、標識プライマーの量を極端に少なくすることで、未反応標識プライマーを減らす事が可能であることを確認した。
また、これまでに、装置の試作をおこない、既設のFCS装置の試料台を電動化を行い、96ウェルならびに384ウェルのコントロールを可能を目指している。
試作装置の製作と平行してカバーガラスが底辺に張られて96ウェルを利用して、新規に購入したPCR装置を利用してPCRの温度変化に耐えられるかどうかを検討した結果、温度の上昇、ならびに滑降温度速度を緩やかにすることで克服することができたがさらに改良が必要である。
また、研究の過程で、SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)にの検出にの可能性についても見当を行い、2色の蛍光色素を別々のプライマーにラベルを行い、検出することが可能であることを確認した。
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[Publications] Gong, J.: "Synthesis of hydrogels with extremely low surface friction"J. Am. Chem. Soc.. 123. 5582-5583 (2001)
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[Publications] N. Yoshida: "Fluorescence correlation spectroscopy : A new tool for probing the microenvironment of the internal space of organelles"Single Molecules. 1. 279-283 (2001)
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[Publications] Y. Nomura: "Monitoring of in vivo and in vitro translation of green fluorescence protein and its fusion proteins by fluorescence correlation spectroscopy"Cytometry. 44. 1-6 (2001)
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[Publications] N. Yoshida: "Microenvironment of endosomal aqueous phase investigated by the mobility of microparticles using fluorescence correlation spectroscopy"Biochem. Biophys. Res. Comm.. 280. 312-318 (2001)
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[Publications] Fodes-Papp Z.: "Fluorescence correlation spectroscopy in nucleic acids analysis In : E Elson, R Rigler(Eds), Fluorescence Correlation Spectroscopy - Theory and Applications, Springer Series in Physical Chemistry, Volume65"Springer, Boston. 487 (2001)
