質量分析による糖蛋白質糖鎖高感度構造解析法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12558077
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高尾 敏文 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (10197048)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福田 宏之 アプライドバイオシステムズジャパン, バイオディスカバリー部門, マネージャー(研究職)
• Keywords: 質量分析 / 糖蛋白質 / 糖鎖 / 化学誘導化 / 逆相担体 / 糖ペプチド

Research Abstract

二次元電気泳動などから得られるピコモル以下の微量糖蛋白質糖鎖の構造解析を確立する目的で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離された糖タンパク質に対して、糖ペプチドのエレクトロスプレーイオン化(ESI)タンデム質量分析による糖鎖構造解析、及び、糖鎖の4-アミノ安息香酸2-ジエチルアミノエチルによる化学誘導化について検討した。ヒトトランスフェリンをモデル糖タンパク質として実験を行った結果、ピコモルレベルの試料で、SDS-PAGE→in-gel酵素消化→(糖ペプチドの分離)→MS/MSによる測定が可能であった。低エネルギー衝突活性化開裂により糖ペプチド糖鎖はグリコシド結合で特異的に開裂を受け、糖の並びや枝分かれ構造に関して有効な情報が得られ、さらに、ESI法と四重極-飛行時間型タンデム質量分析計の組み合わせにより、従来困難であった分子量3000を超える高分子量の糖ペプチドの構造解析が行えることを示した。ゲル中で遊離した糖鎖を直接化学誘導化する方法では、化学誘導化におけるロスを最低限に抑え、また、低分子量の水溶性の共雑物をを除去するために、アミノプロピル基を有するポリマー担体による過剰試薬の除去、逆相担体による脱塩精製を行う方法を確立した。現在のところ、SDS-PAGEへの最低チャージ量として、ヒトトランスフェリンでは10pmolを用いて誘導化糖のLC/ESI-MSによる糖鎖分析が可能であった。

Research Products

• [Publications] Nishiguchi, M., et al.: "Mycoplasma fermentans lipoprotein M161Ag-induced cell activation is mediated by Toll-like receptor 2: Role of N-terminal hydrophobic portion in its multiple functions"J・Immunology. 166. 2610-2616 (2001)
• [Publications] Betancourt, L., et al.: "Selective Isolation and identification of N-terminal blocked peptides from tryptic protein digests"J.Peptide Res.. 57. 345-353 (2001)
• [Publications] Nakagawa, M., et al.: "O-Glycosylation of G-protein-coupled receptor, octopus rhodopsin, Direct analysis by FAB mass spectrometry"FEBS Lett.. 496. 19-24 (2001)
• [Publications] Betancourt, L., et al.: "Dextranase(α-1, 6 glucan-6-glucanohydrolase)from Penicillium minioluteum expressed in Pichia pastoris : two host cells with minor differences in N-glycosylation"FEMS Yeast Res.. 1. 151-160 (2001)
• [Publications] 高尾敏文: "プロテオミクスに向けた質量分析法"Chromatography. 22. 93-94 (2001)
• [Publications] 高尾敏文, 他: "プロテオーム(分析法) 蛋白質・核酸・酵素"共立出版(分担). 1504-1509 (2001)