細胞内1分子計測顕微鏡の開発と細胞内情報伝達研究への応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12558082
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐瀬 一郎 ニコン, マイクロサイエンス, 研究員
• Keywords: 全反射顕微鏡 / MAPK回路 / 細胞増殖 / 会合状態 / ブラウン運動 / カルシウム応答 / EGF

Research Abstract

生きている細胞内を顕微操作しつつ、生体分子や分子複合体の反応を1分子・実時間計測するための光学顕微鏡「細胞内1分子計測顕微鏡」を開発することが本研究の目的である。
作成した装置を実際の細胞システムに応用しながら装置の最適化を図った。最初の応用例として、上皮成長因子(EGF)による細胞情報伝達系の1分子イメージングを行った。上皮成長因子の細胞膜受容体への結合は細胞内カルシウム濃度の上昇をもたらす。蛍光EGFの結合を1分子計測し、カルシウム応答(蛍光カルシウム指示薬で測定する)とEGF結合の相関を解析した。すべての細胞に応答をもたらすのに十分な結合量は細胞当たり150分子であり、応答の大きさは結合数に無相関であった。細胞(HeLa)は数万分子の受容体を発現しているから、1%程度の受容体の反応で細胞応答がOn/Off的に起こることになる。現在、情報伝達反応回路のどの段階がこのスイッチングを行っているか明らかにするため、受容体下流で働きカルシウム応答のセカンドメッセンジャーIP3産生をおこなう酵素PLCγと受容体の相互作用を一分子計測している。
また、昨年作製した装置に光褪色実験用の光学系を組み込んだ、これは、細胞内の一部の場所で蛍光色素標識分子を褪色させ、その後の分子の交換反応を解析することにより、分子運動や分子集積の機構を研究するためのものである。細胞内情報伝達の仲介分子である低分子量G蛋白質Rasは、EGF刺激後の細胞では局所に濃縮しているが、個々の分子はブラウン運動で激しく入れ替わっている。Ras集積の動的平衡を維持する機構を光褪色法で研究する予定である。

Research Products

• [Publications] Ueda, M., Sako, Y., Tanaka, T.et al.: "Single molecule analysis of chemotactic signaling in Dictyostelium cells"Science. 294. 864-867 (2001)