ウレアーゼの活性部位構造制御による新規酸化酵素の創製:高原子価酸素活性種の生成過程の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12640538
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 山口 和也 大阪大学, 大学院・理学研究科, 講師 (80252550)
• Keywords: ウレアーゼ / 酸化酵素 / 生物無機化学 / 金属タンパク質

Research Abstract

メタンモノオキシゲナーゼ、チロシナーゼやカタラーゼなどの酸化酵素の活性部位は、それぞれ鉄、銅およびマンガンイオンの複核構造をとっている。これら金属複核酸化酵素の活性中心構造と機能の相関性について検討するため、類似の金属複核構造を有する加水分解酵素ウレアーゼの金属置換を行い、酸化酵素機能を調べた。ウレアーゼの活性部位には、2つのニッケルイオンが存在し、カルバメートによって架橋された複核構造を有している。ニッケルイオンを、鉄、銅、マンガンイオンに置換した金属置換ウレアーゼを調製した。昨年度では、金属置換ウレアーゼと過酸とを反応させて、ウレアーゼのスペクトル変化を検討したが、成功しなかった。本年度は、金属置換ウレアーゼと過酸以外に、さらに基質となるグアイヤコールを添加することにより、金属置換ウレアーゼの酸化反応性を検討した。その結果、銅置換ウレアーゼにおいて、顕著なスペクトル変化が観測され、基質が酸化されたことが見いだされた。この観測は、金属置換によってウレアーゼの機能を改変することに成功したことを意味している。ウレアーゼの活性部位を反応コアとした新規酸化酵素が創製された。さらに、金属複核を架橋するカルバメート基がある酵素、無い酵素を作り分け、酸化反応性を検討した結果、K_m, V_<max>および至適pHなどの基礎的酵素反応パラメータには、架橋の有無による大きな違いは認められなかった。この結果は、本新規酵素において、金属複核における架橋アミノ酸残基は、重要な構造要因ではないことを意味している。本研究成果によって、金属タンパク質の金属置換は酵素機能改変を引き起こすことを見いだし、創製した新規酸化酵素の反応性を検討することによって高原子価酸素活性種の生成過程に対する活性中心構造要因に関する知見を得ることができた。