「2ドメイン」構造をもつ酵母ヘモグロビンの分子生理学的研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12640659
• Research Institution: FUKUSHIMA MEDICAL UNIVERSITY
• Principal Investigator: 松岡 有樹 福島県立医科大学, 医学部, 助教授 (30222293)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田嶋 玄一 東北大学, 大学院・理学研究科, 助手 (00197360) ; 四釜 慶治 PHP研究所, 所長 (40004337) ; 落合 威彦 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (40075031)
• Keywords: ヘモグロビン / ミオグロビン / 酵母 / 自動酸化反応 / 大量発現系 / 2ドメイン構造 / フラビン / 酸触媒

Research Abstract

酵母ヘモグロビンは「酸素結合ドメイン」と「還元酵素ドメイン」とから成っているが、本研究では、まず「分子全体」を発現させるベクター(pMAL-c2/Candida Hb)と「酸素結合ドメイン」のみを発現させるベクター(pMAL-c2/heme domain)とを作製した。次に、それらを大腸菌に導入して大量培養したのち、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィー法を用いて、whole proteinと酸素結合ドメイン(以下ヘムドメインと記す)とを単離精製することに成功した。
そこで、両者の吸収スペクトルを測定してみると、whole proteinではメト型のSoret peakがオキシ型のそれよりも高くなっているのに対し、ヘムドメインではその関係が逆転していた。このことから、whole proteinのメト型ではヘム鉄(III)に水分子が配位している六配位構造を、ヘムドメインでは水分子の配位していない五配位構造をとっているものと考えられた。したがって、「酸素結合ドメイン」の軸配位子構造にも、「還元酵素ドメイン」が大きな影響を与えていることが分かった。
次に、ヘム鉄に結合した酸素分子の安定性を調べるため、オキシ型(HbO_2)からメト型(metHb)への自動酸化速度を、25℃、0.1M buffer中で、pH4から9までの広い領域に渡って詳細に測定した。その結果、ヘムドメインのみの場合は、全てのpH領域でwhole proteinよりも自動酸化を受けやすいことが分かった。一方、whole proteinでもヘムドメインでも、その自動酸化速度は酸性側で共に増大するが、pHに対する傾きはせいぜいn=-0.5程度であり、しかもpH4付近になると速度の飽和が見られた。したがって、酵母ヘモグロビンの自動酸化反応には、遠位His残基を介して発現される酸触媒項は全く含まれていないものと結論された。

Research Products

• [Publications] Korenaga, S.: "A primitive myoglobin from Tetrahymena pyriformis : Its heme environment, autoxidizability, and genomic DNA structure"Biochim. Biophys. Acta. 1543. 131-145 (2000)
• [Publications] Suzuki, T.: "Dual nature of the distal histidine residue in the autoxidation reaction of myoglobin and hemoglobin : comparison of the H64 mutants"Eur. J. Biochem.. 267. 6166-6174 (2000)
• [Publications] 四釜慶治: "ミオグロビン・ヘモグロビンの自動酸化反応 -その分子機構と結合酸素の安定性-"生物物理. 234. 74-79 (2001)
• [Publications] 落合威彦: "呼吸調節の系統発生:特にconstant relative alkalinityについて"LiSA. 8. 686-692 (2001)
• [Publications] Yasuda, J P.: "The α1β1 contact of human hemoglobin plays a key role in stabilizing the bound dioxygen : Further evidence from the iron valency hybrids"Fur. J. Biochem.. 269. 202-211 (2002)
• [Publications] Shikama, K.: "Human hemoglobin and its heme oxidation : A new paradigm for oxygen stabilization involving the α1β1 contact"Trends in Comparative Biochemistry and Physiology. (In press). (2002)
• [Publications] Matsuoka, A.: "Yeast Flavohemoglobin from Candida norvegensis : Its Structural, Spectral, and Stability Properties"Proceedings of the XIIth International Conference on Invertebrate O_2 Binding Proteins. (In press). (2002)