2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素の結晶構造と機能の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660067
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 若木 高善 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (70175058)
• Keywords: 2-オキソ酸 / フェレドキシン / 酸化還元酵素 / 古細菌 / 耐熱性酵素

Research Abstract

[1] Sulfolobus sp.strain 7 のOFORのX線結晶構造解析について、市販の100通り以上の結晶化条件を検索し、結晶化の可能性のある数種類の条件について、絞り込みを行い、形状の優れた結晶について、学内のR-axisIV、筑波の高エネルギー研究所、播磨のSpring8において、X線回折写真を撮影した。分解能向上のために、今後さらに、結晶化の条件検討、基質やコファクターとの共結晶、部分分解酵素の結晶化などを検討する必要がある。
[2] Sulfolobus sp.strain 7のOFORの活性中心残基の同定
既にaサブユニットの保存配列YPITPの各部位の変異体を作成して性質を調べた。20近い変異体を作成して解析したが、このモチーフは基質の結合ではなく、代謝の回転にとって重要である、という結論が導かれた。この結論は、最近フランスのグループが初めて発表した細菌型OFORのX線結晶構造の結果、例えばモチーフのThrは基質との結合に重要とする推測、とは対照的であり、今後議論を引き起こすことになろう。
また、上の構造解析を参考に、基質2-オキソ酸の結合に結合に関与すると考えられる5個の残基をSulfolobus OFORで特定し、20近い変異体を作成して解析した。この中のArg344は活性に必須であり完全に保存された残基であることがわかった。
[3] 他のOFOR遺伝子の産物の解析
100℃でも生育する超好熱性古細菌Aeropyrumのゲノムには2つのサブニットからなるOFORが2組ある。
これらを発現させて機能を調べたが、いずれもピルビン酸を主な基質とするものの特異性は厳密でなかった。

Research Products

• [Publications] 福田英理子: "遺伝子の効率的な発現系を用いた好熱性古細菌由来の酸化還元酵素の機能解析"第23回日本分子生物学会年回プログラム・講演要旨集. 759 (2000)
• [Publications] 福田英理子: "好熱性古細菌Sulfolobus sp.strain 7の2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素(OFOR)の構造と機能"日本農芸化学会誌. 74. 250 (2000)
• [Publications] 西澤由美恵: "好熱性古細菌Aeropyrum pernixの2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素に関す"日本農芸化学会誌. 74. 250 (2000)
• [Publications] 仮谷俊博: "好熱性古細菌Sulfolobus sp.strain 7フェレドキシンの亜鉛結合部位の研究"日本農芸化学会誌. 74. 250 (2000)