哺乳類雄性生殖細胞の増殖分化に関連する特異的遺伝子発現の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660250
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 金澤 卓弥 茨城大学, 農学部, 助手 (70272119)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河本 馨 日本獣医畜産大学, 獣医畜産学部, 教授 (30011894) ; 小川 恭善 茨城大学, 農学部, 助教授 (00302331)
• Keywords: 雄性生殖細胞 / 差次的遺伝子発現 / 単クローン抗体

Research Abstract

本研究は哺乳動物の雄性生殖細胞の増殖分化の過程で特異的に発現する遺伝子を探索すること、および雄性生殖細胞を同定するための単クローン抗体の作製および性状解析を行うことを目的とした。まず精子形成期において特異的に発現する遺伝子を探索するために、精子形成開始前と精子形成開始後の雄ヤギから精巣を摘出し、それぞれの組織中より総RNAを定法により抽出した。これを鋳型として逆転写反応を行い、cDNA断片を作製した。さらにディファレンシャルディスプレー法により2つの異なる時期において差次的に発現する遺伝子のcDNAを検出した。同様の実験を繰り返して行い、再現性の認められたcDNAを回収し、さらにPCR標識法によりシゴキシゲニン標識cDNAを作製した。これをプローブとしてドットブロット法による精巣組織中のmRNAを半定量的に測定した。発現量に明らかな差が認められたcDNA断片をTAクローニングベクターを用いてクローン化を試みた。一方、精細管構成細胞を特異的抗体を用いて認識同定するために、精子形成期のヤギ精巣から酵素消化法により組織構成細胞を分散し、これをマウスに免役して単クローン抗体の作出を試みた。免役したマウスから脾細胞を無菌的に取り出し、マウス骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させた。まずエライザ法を用いて抗体産生ハイブリドーマを選択した。次に、精巣構成細胞を用いて免疫細胞染色法を行い、陽性染色を示したハイブリドーマを選別した。また、限界希釈法を用いて陽性細胞をクローン化した。これら一連の方法により数千個のハイブリドーマコロニーから数十個クローン性抗体産生ハイブリドーマを樹立した。これらの抗体産生ハイブリドーマが産生した単クローン抗体を用いて精子形成期の精巣組織切片の免疫組織染色法を行い、それぞれの免疫染色の局在を調べた。

Research Products

• [Publications] Kanazawa, T., Kohmoto, K.: "Immunochemical demonstration of αs1- and β-casein in mouse mammary glands at early stages of pregnancy."Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50(2). 257-264 (2002)
• [Publications] Kanazawa, T., Aizawa, S., Tomooka, Y.: "Estalishment and characterization of cell lines cloned from mammary epithelium of p53-deficient mice."Proceedings of the AACR. 93. (2002)
• [Publications] 笠原 靖, 金澤卓弥, 小杉山基昭: "ラット脂肪組織より分離した初代未分化細胞の増殖および脂肪細胞への文化に及ぼす共培養成熟脂肪細胞の影響"日本畜産学会報. (2002)