ホヤ初期胚単離細胞を用いた神経誘導系における転写活性の可視化による解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670048
• Research Institution: Meiji Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 田中 資子 (國嶋 資子) 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (80277730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 國太郎 東京大学, 医学系研究科, 名誉教授 (10010034)
• Keywords: ホヤ胚細胞神経誘導系 / 4細胞胚A3割球 / 表皮分化と神経分化 / TuIRKA / プロモーター / GFP / 転写活性 / 蛍光発現

Research Abstract

本研究計画では、ホヤ単離8細胞胚a4-2割球神経誘導系に加え、これよりさらに大型かつ多分化能を有する予定神経領域を含む単離4細胞胚頭側割球A3に、表皮細胞初期マーカーとしてGFP遺伝子と融合して転写活性を可視化したIRK遺伝子プロモーターを外来性に導入し、予備的実験からわかっているA3割球の誘導割球との接着あるいはbFGFによる神経分化決定過程における表皮マーカーの転写抑制反応の時間経過を定量的に解析することにより、神経誘導が表皮分化の抑制であるのか、神経分化の脱抑制であるかを明らかにする。
本年度の研究実績
(1)4細胞胚から単離した頭側A3割球を用いた新神経誘導系の作成
予備的実験から予定神経領域を含む超大型のA3割球は二個の8細胞胚a4-2割球と発生8時間までに接着すると神経細胞に分化し、10時間以降に接着すると表皮細胞に分化することがわかっている。一方、同じA3割球を単離してあるいは8細胞胚の誘導割球A4-1と接着培養すると不完全な神経細胞様分化を示す。この新しい神経誘導系の詳細を生理学的に解析した。この実験のために、AXON社パッチクランプ用増幅器(Axopatch-1D)を購入した。
(2)転写因子活性を可視化するための実験
ゲノムライブラリーよりクローニングしたホヤ初期表皮細胞マーカーIRK遺伝子(TuIRKA)のプロモーターにGFP融合蛋白遺伝子を結合して8細胞胚a4-2A4-1分裂抑止神経誘導系のa4-2割球に注入、GFP蛍光発現を指標として神経誘導時点での転写活性の抑制、a4-2a4-2割球接着あるいはb4-2b4-2割球接着による表皮分化に伴う転写活性の上昇を継時的に定量した。またIRK遺伝子の詳細な制限酵素地図を作成するとともに、プロモーター、イントロン領域を含め関連する遺伝子座を決定した。

Research Products

• [Publications] TANAKA-KUNISHIMA.M.,Ishida,Y.and Takahashi,K.: "Early epidermal and neural differentiation processes visualized by GFP-linked IRK promoter activity in isolated ascidian ectodermal blastomeres."Neuroscience Research. Suppl.24. S82 (2000)
• [Publications] TANAKA-KUNISHIMA.M.,Ishida,Y.and Takahashi.K.: "New neural induction in ascidian cleavage-arrested embryonic cell system and promoter activity of 5'proximal region of genomic TuIRKA in this system."Japanese Journal of Physiology.. 50.Suppl(in press). (2000)