過酸化水素および一酸化窒素耐性細胞からの新規抗酸化ストレス遺伝子のクローニング

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670146
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 錦見 盛光 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20022816)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 道之 横浜市立大学, 理学部, 教授 (10076995) ; 井内 陽子 和歌山県立医科大学, 医学部, 助手 (20316087)
• Keywords: 抗酸化ストレス遺伝子 / 過酸化水素耐性 / HL60細胞 / サブトラクション法 / アルカリホスファターゼ

Research Abstract

H_2O_2耐性HL60細胞(HP100-1)と親細胞のHL60細胞との間で、発現量に差のある遺伝子は、細胞の抗酸化ストレス関連遺伝子であると考えられる。まず、両細胞のタンパク質を二次元電気泳動で解析し、その結果耐性細胞で増加しているタンパク質を少なくとも2つ認めた。次に、両細胞のmRNAで量的に差のあるものをClontech社のPCR-Select Subtruction Kitを用いて、両者のmRNAに対するcDNAの間で相互にsubtructionを行い、得られたcDNAクローンの塩基配列の決定とそのcDNAをプローブとして用いる両細胞のRNAドットブロット分析を行った。その結果からHP100-1で発現が増強している遺伝子としてカタラーゼ、eosinophil granule basic protein、diaphanous1などが見出された。また、HP100-1ではミエロパーオキシダーゼ遺伝子の発現が減っているという結果が得られた。これはパーオキシダーゼがH_2O_2との反応で細胞を障害するため、これが発現しないことがH_2O_2耐性に有利に働くことを示している。さらに、細胞内での酸化ストレスのレポータータンパク質を発現するCHO細胞の作製を行った。大腸菌のアルカリホスファターゼのリーダーペプチドを含まないタンパク質をコードする遺伝子DNAを真核細胞発現ベクターpRc/CMVを用いて、同酵素を恒常的に発現するCHO細胞を得て、そのチオール基が細胞内で酸化されて分子内S-S結合ができて活性が出現する条件を検討している。