過酸化水素および一酸化窒素耐性細胞からの新規抗酸化ストレス遺伝子のクローニング

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670146
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 錦見 盛光 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20022816)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 道之 横浜市立大学, 理学部, 教授 (10076995) ; 井内 陽子 和歌山県立医科大学, 医学部, 助手 (20316087)
• Keywords: 過酸化水素耐性 / HL60細胞 / 差次的クローニング / Rpn9 / プロテアソーム / NO耐性

Research Abstract

H_2O_2耐性HL60細胞(HP100-1)と親細胞のHL60細胞の間で、発現量に差があるmRNAを差次的クローニング法を用いて検索中に、プロテアソームの19S調節ユニットを構成するサプユニットの一つRpn9を拾い上げた。Rpn9の酵母のホモローダの破壊株が既に作られていたので、これを入手しH_2O_2に対する耐性を野生株と比較したところ、破壊株の方が耐性が大であった。H_2O_2処理後の酸化タンパク質(カルボニル化の程度で評価)の減少速度は、上記破壊株の方が野生株に比べて顕著に大きかった。さらに、両株のプロテアソームによるタンパク質分解活性を非変性条件下の電気泳動ゲル上で調べた結果、上記破壊株では20Sプロテアソームおよびこれより少し遅れて泳動される分子種の活性が増加していた。この活性の増加は、抗20Sプロテアソームサブユニット抗体を用いたウエスタンブロットによって、これらの分子種の増加によるものであることを確認した。両株ともH_2O_2処理により、これらの分子種の活性が増加の傾向を示した。したがって、酸化的傷害を受けたタンパク質の分解処理に20Sプロテアソームやこれに類した分子種が関与している証拠が得られた。さらに、NO耐性HL60細胞で発現量の多いmRNAの検索を差次的クローニング法で行い、ミトコンドリアDNAでコードされるシトクロム酸化酵素とATP合成酵素のサブユニットを拾い上げた。現在、それらの発現レベルを調べている。これらの研究の他にキレート化によって抗酸化ストレス作用を発揮するタンパク質が細胞内に多数存在することを見出し、Cu(I)とタンパク質チオール基との相互作用が重要であることを証明した。

Research Products

• [Publications] Y.Ohta, Y.Inai, M.Nishikimi, et al.: "Ascorbate-Induced High-Affinity Binding of Copper to Cytosolic Proteins"Biochem. Biophys. Res. Commun. 287・4. 888-894 (2001)