肝組織移植による肝疾患治療のための基礎的研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670211
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 三高 俊広 札幌医科大学, 附属がん研究所, 助教授 (50231618)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹田 寛 札幌医科大学, 附属がん研究所, 助手 (00333310)
• Keywords: 小型肝細胞 / 幹細胞 / 増殖 / 成熟化 / 細胞外基質 / scaffold / 移植 / 凍結保存

Research Abstract

我々は、成熟ラット肝臓より肝幹細胞の一種と考えられる小型肝細胞を分離培養し、増殖と成熟肝細胞への分化を調節する方法を見いだした。小型肝細胞は増殖しコロニーを形成し、非実質細胞、特に星細胞の分泌する細胞外基質が小型肝細胞の周りに蓄積することによって成熟化し、3次元的な類肝組織を形成する。小型肝細胞のコロニーはsubcultureすると非実質細胞の増殖が抑制され、増殖が促進される。その小型肝細胞に基底膜成分からなる細胞外基質(Matrigel)を投与すると成熟化が誘導される。細胞外基質は基底膜様構造を形成していることが必要で、type IV collagen, lamininなど個別の投与では、組織構築を誘導することができなかった。分化誘導を受けた小型肝細胞は、培養後、数週間経過しているにも関わらず成熟肝細胞が豊富に発現している転写因子のHNF4, HNF6, C/EBPalphaなどを強く発現するようになり、それら転写因子によって発現調整されているアルブミン、トランスフェリンばかりではなく、尿素合成に必要なCarbamoyl-phosphate synthetase Iやアンモニア代謝に必要なGlutamine synthetaseが発現するようになり、薬物代謝のCytochrome P450の誘導がかかるようになる。この結果は、成熟化した小型肝細胞が生体内の肝細胞と同等な機能を発揮できるということである。
小型肝細胞はコロニーの状態での長期間の凍結保存(液体窒素を使うことなく-80°Cで良い)が可能で、最長90週凍結保存した小型肝細胞を増殖させることに成功した。平均60%の生着率で、生着した小型肝細胞は増殖する。2週間でコロニーの面積にして約7倍に、アルブミンの産生は約5倍になる。凍結保存した小型肝細胞も成熟化を誘導することが可能で、subcultureした場合とほぼ同様の結果を得ている。また、小型肝細胞のコロニーを、コラーゲンからなるscaffoldの中で培養すると成熟化が誘導され、非実質細胞は胆管形成や毛細血管の形成を行うようになった。現在、このscaffoldで組織構築した類肝組織をヌードマウスやラットに移植する実験を継続して行実施し、生体内での組織化の検討を行っている。

Research Products

• [Publications] 三高俊広: "肝臓における幹細胞システムと肝組織構築(総説)"実験医学. 18(4). 431-437 (2000)
• [Publications] Toru Mizuguchi: "Paper is compatible bed for rat hepatocytes"Artificial Organs. 24(4). 271-277 (2000)
• [Publications] 三高 俊広: "肝臓の幹細胞(総説)"Molecular Medicine. 38(1). 8-15 (2001)
• [Publications] Toshihiro Mitaka.: "Hepatic Stem Cells ; From Bone Marrow to Hepatocytes (Review)"Bicohemical and Biophysical Research Communication. 281(1). 1-5 (2001)
• [Publications] 三高俊広, 他: "肝臓の再生(総説)"肝胆膵. 42(2). 195-201 (2001)
• [Publications] Koichi Hirata, et al.: "Sepsis and cholestasis : basic findings in the sinusoid and bile canaliculus. (Review)"Journal of Hepatobiliary Pancreatic Surgery. 8(1). 20-26 (2001)
• [Publications] 三高俊広, 他: "肝臓の幹細胞システム(総説)"GI Research. 19(3). 229-234 (2001)
• [Publications] Nagato Higaki et al.: "Maitenance of connexin 32 and 26 expression in primary cultured rat hepatocytes treated with 3-acetylpyridine"Journal of Gastroenterology and Hepatology. 16(7). 806-815 (2001)
• [Publications] Toru Mizuguchi, et al.: "Regulation of c-met expression in rats with acute hepatic failure"Journal of Surgical Research. 99(2). 385-396 (2001)
• [Publications] Toru Mizuguchi et al.: "Enhanced proliferation and differentiation of rat hepatocytes cultured with bone marrow stromal cells"Journal of Cellular Physiology. 189(1). 106-109 (2001)
• [Publications] Toshihiro Mitaka, et al.: "Expression of carbamoylphosphate synthetase 1 and glutamine synthetase in hepatic organoids reconstructed by rat small hepatocytes and hepatic nonparenchymal cells"Cell and Tissue Research. 306(3). 467-471 (2001)
• [Publications] 三高俊広: "動き出した再生医療の臨床〜肝臓〜"分子細胞治療. 1(1). 78-85 (2002)
• [Publications] Toru Mizuguchi et al.: "Effects of bone marrow stromal cells on the structural and functional polarity of primary rat hepatocytes"In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal. (in press). (2002)
• [Publications] Nagato Katsura et al.: "Long-term culture of primary human hepatocytes with preservation of proliferative capacity and differentiated functions"Journal of Surgical Research. (in press). (2002)
• [Publications] Shinichiro Ikeda, et al.: "Proliferation of rat small hepatocytes after long-term cryopreservation"Journal of Hepatology. (in press). (2002)
• [Publications] Toshihiro Mitaka, et al.: "The Hepatocyte Review : Chapter 14"Kluwer Academic Publishers (Dordrecht, The Netherlands). 624 (2000)
• [Publications] 池田慎一郎, 他: "幹細胞・クローン研究プロトコール:第5章 肝前駆細胞からの増殖と分化:小型肝細胞(small hepatocyte)の分離方法"羊土社、東京. 254 (2001)