2000 Fiscal Year Annual Research Report
細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインに基づく機能性薬物の設計と応用
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12670258
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| Research Institution | Kagawa Medical School |
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Principal Investigator |
松下 治 香川医科大学, 医学部, 助教授 (00209537)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片山 誠一 香川医科大学, 医学部, 助手 (70169473)
西 望 香川医科大学, 医学部, 助手 (10145047)
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| Keywords | クロストリジウム / コラゲナーゼ / コラーゲン結合ドメイン / ベータ・サンドイッチ / コラーゲン様領域 |
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| Research Abstract |
1.CBD内の基質結合部位の同定(担当:松下)
CBD(ColG S3b)のセレノメチオニン誘導体をDoblieらの培養条件により生産・精製した後、X線結晶学的解析(MAD法)により立体構造の決定(分解能1.5Å)を行った。CBDは、5本および4本のストランドよりなるβシートが重なったベータ・サンドインチ構造を有していた。
CBDのアミノ酸配列を比較したところ、予想される8本の両親媒性βストランドの親水面側に配向すると考えられる残基のうち10残基が保存されていた。これらのアミノ酸残基を部位特異的にアラニンに置換し、変異タンパク質の結合能(Kd)を、Gly-(Pro-Pro-Gly)_8を固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて定量した。変異により結合能が低下したアミノ酸残基は、いずれもベータ・サンドイッチの片面に集中して存在していたので、この部位が基質結合部位であると考えられる。
2.基質特異性の検討
I型以外のコラーゲンを豊富に含む腎臓、軟骨、動脈壁などの組織を固定・包埋後、ポスト法によりCBDを結合させた。アフィニティー精製した抗CBD家兔抗体を用いて免疫染色を行い、光顕的、電顕的にCBDの結合を検討した。CBDはいずれの組織の結合組織にも良く結合した。in vitroの結合実験でもCBDが認識する基質スペクトルは同様の結果であったので、CBDの認識部位は種々の型のコラーゲンに共通の領域、すなわちcollagenous domainであることが示唆された。
3.新規コラーゲン結合ドメインの検索
3種のClostiridium属細菌からコラゲナーゼを精製し、N末端アミノ酸配列を決定した。degenerate primerを用いて、これらの酵素の構造遺伝子の一部をクローン化し、塩基配列を決定した。現在、構造遺伝子全長のクローン化に着手したところである。
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