エタノールによるミトコンドリアの融合と巨大化-培養心筋細胞を用いた数量的解析-

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670408
• Research Institution: NIPPON MEDICAL SCHOOL
• Principal Investigator: 真下 啓子 日本医科大学, 医学部, 助手 (90113000)
• Keywords: 培養心筋細胞 / エタノール / ミトコンドリア / 巨大化 / 生体蛍光染色 / flow cytometry / ミトコンドリア膜電位

Research Abstract

「エタノールによるミトコンドリアの融合・巨大化は、呼吸能の低下を代償する機構である」という仮説を検証するとともに、その融合・巨大化のメカニズムの解明を目的とする。
心筋細胞のミトコンドリアに対するエタノールの影響を検討するために、初代培養した心室筋細胞を0,50,200mMのエタノール培養液に曝露し、1,3,24時間後に、以下の方法でその変化を計測した。
(1)【ミトコンドリアの蛍光顕微鏡観察】顕微鏡でもJC-1赤色蛍光のエタノールによる増加を確認した。
(2)【ミトコンドリアの巨大化のflow cytometryによる数値化】ミトコンドリアのswelling(膨化)の指標として、flow cytometryの物理光学的因子のFSC(細胞の大きさ)とSSC(細胞内の複雑さや粒子の量)の比(FSC/SSC)を計算した。心筋細胞のFSC/SSCは、エタノール曝露後1時間では非曝露群と比べて変化がなく、3時間では少し増加したが、24時間では濃度依存的に減少した。一方、初代培養時に得た非筋細胞(線維芽様細胞)のFSC/SSCは、エタノール濃度に関係なく、終始わずかに増加した。このことから、培養心筋細胞のミトコンドリアは、エタノール曝露によりswellingを起こすことはなく、むしろ、非筋細胞と異なって、ミトコンドリアが増大することが、物理的因子からも示された。
(3)【シグナル伝達系の関与】各種シグナル伝達因子の特異的DNA配列をコートしたプレートを使ったELISA法を試みたが、初代培養で得たマウス心筋細胞数は推奨の1/10以下のため、プレートリーダーの吸光度値はその差を検定できる程大きくなく、断念した。代わりに、FITCラベル2次抗体を用いてNF-κ B p65量をflow cytometryで測定した。心筋細胞の50mM曝露ではほとんど変化がなかったが、200mM曝露後1と24時間で増加した。一方、非筋細胞の50mMで減少傾向があったが、200mMでは大きな変化はなかった。ミトコンドリア巨大化にNF-κ B の関与の可能性が示唆され、かつ、少数の細胞サンプルの特定の蛋白の変動の検出に、flow cytometryが有用であることが示された。
(4)【熱ショック蛋白(Hsp)の発現】(3)と同様に、flow cytometryで測定を試みているところである。

Research Products

• [Publications] Mashimo, K., Sato, S., Ohno, Y.: "Chronic effects of ethanol on cultured myocardial cells : Ultrastructural and morphometric studies"Virchows Archiv. 442(in press). (2003)
• [Publications] 真下啓子, 佐藤茂, 大野曜吉: "Flow cytometric analysis of ethanol-induced mitochondrial gigantism of cultured mouse ventricular myocardial cells"Jpn. J. Alcohol & Drug Dependence. 37(4). 348-349 (2002)