不死化ヒト肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671175
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 猪口 貞樹 東海大学, 医学部, 教授 (60160008)
• Keywords: 初代培養ヒト肝細胞 / アデノウイルスベクター / 遺伝子導入 / SV40T抗原 / 形質転換コロニー / 不死化 / ハイブリッド型人工肝臓

Research Abstract

【目的】初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。片山時孝(東海大学・医学部)は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサル初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子導入、形質転換させうること、長期培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。
今回(片山時孝が出向により研究代表者交代によるため)同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成12年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みた。
【方法および結果】ヒトアデノウイルス5型のE1A, E1B遺伝子を複製能欠損SV40初期遺伝子と組み替えたアデノウイルスベクターをMOI(multiplicity of infection)100でヒト初代培養肝細胞に感染させ長期継代培養を行なったところ18ヶ月以上にわたり増殖しており不死化した。不死化ヒト肝細胞は大量培養が可能で安定供給できるようになった。単層培養による継代培養を継続していくと尿素合成能およびチロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)活性が低下することが認められた。3次元培養することでこれら機能がよりよく温存されることが示唆されたためpoly-N-vinylbenzyl-β-D-lactonamide(PVLA)シャーレ上で3次元培養を行いスフェロサイトを形成させ高密度3次元培養を行なっているが至適培養環境を検討中である。
【結語】不死化ヒト肝細胞の大量培養が可能となりヒト肝細胞の安定供給を確立した。高密度3次元培養の至適培養環境については現在検討中である。