| Research Abstract |
我々は,p53特異的,HLA-A24拘束性のcytotoxic peptideをmappingすることを最終目的とし,ヒトとマウスのp53の相同性より,候補peptideをstandard solid phase synthesis methodにより合成した.まずこれらのpeptideがHLA-A24分子と結合しうることを確認するために,酸処理後にflow cytometry用いて評価するpeptide binding assayを確立した.C1RA24細胞(HLA-A,B,C null cellのC1R細胞にHLA-A24をtransfectした細胞)をcitrate phosphate bufferで酸処理した後,候補としたpeptideを添加し,抗class I抗体(W6/32)を用いてflow cytometry(FACS caliber,Becton Dickinson)で蛍光強度を測定することで,peptideのbinding affinityを決定した.基礎実験より,最も効率よくpeptideをacid elution可能なcitrate phosphate bufferのpH,温度,時間を決定し,さらに, peptide結合の測定に最適な時間,温度,濃度などを決定した.確立したacid stripping peptide binding assayは,すでに,competitive binding assayでbinding affinityが測定されているHER2/neuやCEAのpeptideを用いた検討により,両assay間には有意な負の相関(r=-0.834, p<0.01)を認めた.マウスのKdおよびKb拘束性のcytotoxic peptideより類推し,合成したヒト野生型p53由来の候補peptide,PU137(ヒトp53のN末端より137-148,LAKTCPVQLWVD),PU161(161-169,AIYKQSQHM),PU235(235-243,NYMCNSSCM)の,HLA-A24に対するbinding affinityを,確立したbinding assayにて検討した結果,3つのうち2つのpeptideがHLA-A24に十分に結合することが明らかとなった.これらのpeptideと,HLA-A24陽性健常者の樹状細胞を用いてCTLを誘導し,そのCTLの解析を現在行っている.
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