滑膜線維芽細胞のアポトーシスにおけるcalpainの発現

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671405
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 清水 克時 岐阜大学, 医学部, 教授 (90170969)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 芳毅 岐阜大学, 医学部, 助手 (10313884)
• Keywords: calpain(カルパイン) / apoptosis(アポトーシス) / signal transduction(シグナル伝達)

Research Abstract

目的)リウマチ滑膜線維芽細胞(以後SFC)を用い酸化的刺激として過酸化水素および,apoptosiカルシイウムイオノフォアとしてA23187を中心にnecrosis,necrosiss等の細胞死が誘導されるかどうかを、またその際のcalpainを中心としたシグナル伝達経路を調べた。結果)3〜8代継代したSFCにA231871uM,H_2O_210^<-3>M,Tapsigargin 1uM,Cisplatin 10ug/ml,Fas ligand 100nMの濃度にて投与し12時間後に形態学的観察を行う。controlと比較しA23187、H_2O_2、Fas ligand 100nMでは細胞質の収縮、一部の細胞で核の凝縮らしき像を認めた。またそれぞれの刺激に対し12時間後にanti α-fodrin抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うとA23187,H_2O_2,Tapsigargin,Fas ligandでは230kDのα-fodrinの分解が起こっていた。また同時期でのcaspase3の抗体を用いてウエスタンブロッティングではFasligandにてcaspase3の分解が生じた。H_2O_2に注目し10^<-5〜-3>Mの濃度にて投与し12時間後に形態学的観察を行なった顕微鏡下にて10^<-5>,10^<-4>Mではcontrolに比して変化を認めなかったものの10^<-3>M投与後において細胞質の収縮を認めた。H_2O_210^<-3>M刺激にて炎症性シグナル伝達の示標となる転写因子であNFkappaBをゲルシフトアッセイにより調べた。刺激後10分後に発現の増強が認められた。同時期に得られた細胞質分画と濃縮したメディウムのそれぞれでm-calpainの発現をウエスタンブロッティング法にて検出した。細胞質分画より90Kバンドが検出されたが経時的な発現の変化を認めなかった。