アポトーシス誘導遺伝子baxおよび自殺遺伝子を融合させた膀胱癌に対する遺伝子治療

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671567
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 柴田 雅朗 大阪医科大学, 医学部, 助教授 (10319543)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大槻 勝紀 大阪医科大学, 医学部, 教授 (50140166)
• Keywords: 膀胱癌 / 単純性ヘルペスチミジンキナーゼ / bax / 遺伝子治療 / Electroporation / ラット / アポトーシス / 非ウイルスベクター

Research Abstract

自殺遺伝子のHSVtkは薬剤であるgancidovir(GCV)を代謝するとその毒性のため細胞死に至らせる。そこで、アポトーシス誘導遺伝子のbaxとHSVtkの膀胱癌に対する効果を検討した。In vitroにおいて、Bax, HSVtKあるいは両者遺伝子の複合体を膀胱癌細胞(ヒトおよびマウス)に遺伝子導入した結果、Bax単独の殺傷効果は弱く(約30%の細胞が死滅)、HSVtk/GCV群では50〜60%の細胞が死滅した。しかし、HSVtk/GCV+Bax投与では複合効果は見られず、むしろHSVtk/GCV群より若干、劣っていた。そこで、以下のin vivoでの実験ではHSVtk/GCVを選択した。
F344系雌ラットに250ppmのBBNを6ヶ月間に渡り投与し、膀胱癌を誘発させた。麻酔下にてラットを開腹し・膀胱頂部より膀胱腫瘍にレポーター遺伝子(β-ガラクトシダーゼおよびGFP)を50μg注入し、EGTした。その後、腫瘍内でのレポーター遺伝子の発現を経時的に追跡した結果、EGT後の4〜7日で強発現し、2週後でも発現は観察された。次に膀胱腫瘍内にHSVtk,空vectorをEGTにより導入し、GCVをi.p.投与した。8日後に全例を屠殺剖検し、病理学的に検索した結果、全ての群で投与部位に壊死が観察されたが、HSVtk/GCV群では強い炎症を伴う有意な壊死面積の増大が観察された。また、この群では腫瘍でのアポトーシスが著しく増加していることをTUNEL assayにより証明したが、BrdU取り込み率によるDNA合成能では低下傾向のみを示した。抗RAM-4抗体で、腫瘍壊死周辺にマクロファージを証明した。本所見はばらつきを示したもののHSVtk/GCV投与で多く観察され、Bystander効果の一端を担っているものと思われた。HSVtk/GCVの膀胱癌細胞への殺傷機構の一端を調べる目的で、in vitroにてマウス膀胱癌細胞にHSVtkを導入した。その48時間後には60%の細胞が死滅し、DNA合成は80%低下した。Flow cytometerを用いた解析では、アポトーシスとネクローシスの細胞集団が観察された。更に、Caspase3が著しく高値を示し、少なくともアポトーシスが生じていることを裏付けた。また、Caspase8および9も有意に上昇していることから、HSVtk誘発の細胞死がミトコンドリア経路である可能性が示唆された。